摘要本文介绍了使用 QuEChERS 快速基质分散固相萃取结合 Agilent 1290 Infinity II-6470B三重四极杆液质联用系统 (LC-MS/MS) 检测凉皮中米酵菌酸的分析方法。该方法使用Agilent Poroshell 120 EC-C18 色谱柱，使米酵菌酸获得了良好的峰形并与基质组分有效分离；在样品前处理中，使用 5% 甲酸乙腈提取，针对样品中是否含油脂分别采用直接提取和 Agilent Bond Elut QuEChERS 分散式 SPE 试剂盒净化，操作过程简便、快速；方法检出限和定量限分别为 5 μg/kg 和 10 μg/kg，灵敏度出色；在 2–100 ng/mL 浓度范围内，米酵菌酸的线性相关系数为 0.9998，表现出良好的线性；在 10–100 μg/kg 的加标浓度下，通过两种样品前处理方法所得到的凉皮中目标化合物的平均加标回收率和相对标准偏差分别为 83.3%–103.3% 和 0.6%–4.3%，表明该方法具有出色的准确度和精密度。该方法适用于定量测定凉皮中的米酵菌酸。
前言米酵菌酸 (Bongkrekic Acid, BA) 是由椰毒假单胞菌属酵米面亚种产生的一种毒素。被该毒素污染的食物可能引起人或动物中毒，重者可致死亡[1]。米酵菌酸热稳定性好，即使烹饪也不易分解，是发酵玉米面制品、变质鲜银耳及其他变质淀粉类制品引起食物中毒的主要原因。误食后可造成多脏器损害、急性中毒甚至死亡，致死率高达 30%–50%，对人们的身体健康和生命安全有巨大的潜在威胁[2]。2023 年 7 月 14 日河南永城“毒凉皮事件”被证实是变质凉皮中米酵菌酸引起的中毒，由此引发对凉皮等湿米制品中米酵菌酸检测的关注。关于食品中米酵菌酸类化合物的检测，GB/T 5009.189-2016[3] 使用 LC-DAD 作为分析系统；用 80 mL 氨化甲醇进行提取，并用阴离子交换固相萃取柱进行净化，实验过程溶剂消耗量大、浓缩倍数高且效率较低。
本实验使用高灵敏度的 Agilent 6470 三重四极杆液质联用系统，基于米酵菌酸（化学结构式见图 1）的结构特点，含有 3 个典型羧基官能团，呈弱酸性，因此酸性条件下能有效避免米酵菌酸的解离，增强其反相保留并改善质谱响应；结构中含有长链不饱和烷烃结构，脂溶性较强，可采用反相色谱保留机理进行分析。另外，考虑到凉皮会在表面上涂抹植物油以防止在储存和运输过程中发生粘连，因此在样品前处理中通过盐析除水溶性淀粉和去除脂肪。本应用使用 5% 酸化乙腈提取后进行盐析萃取，并针对涂抹植物油的凉皮样品，采用含有 C18 吸附剂的 Bond ElutQuEChERS 快速基质分散固相萃取以去除油脂。获得了理想的方法灵敏度、准确度和精密度。
实验部分试剂和样品实验用乙腈、甲醇、甲酸均为色谱纯，购于北京迪马科技有限公司；实验用水为娃哈哈纯净水；米酵菌酸标准品购于曼哈格公司(BePure)，以甲醇为溶剂，浓度为 100 µg/mL；凉皮样品为市售产品。标准品制备取适量米酵菌酸标准品，用乙腈配制成浓度为 1 μg/mL 的标准工作液，逐级稀释后备用。
基质校准标样的配制：准确移取适量的上述标准工作液，用经过样品前处理后的基质空白液进行稀释，分别得到浓度为 2、5、10、20、50、100 ng/mL 的校准标样。临用现配。样品前处理称取凉皮样品，加入水和陶瓷均质子，涡旋混匀后用 5% 甲酸乙腈提取；盐析分层后分别直接过膜进样和经 QuEChERS 分散式SPE 试剂盒净化后进样，使用 Poroshell 120 EC-C18 色谱柱分离，经 LC-MS/MS 进行检测。如图 1 所示为样品前处理操作流程。
检出限和定量限通过空白基质加标回收实验来确定方法检出限和定量限。当加标浓度水平为 5 μg/kg 时仍可定性检出米酵菌酸，且信噪比 (S/N)大于 3，由此确定方法检出限为 5 μg/kg；当加标浓度为 10 μg/kg时，S/N 大于 10，且回收率和精密度满足国家标准相关要求，由此确定方法定量限为 10 μg/kg，优于 GB/T 5009.189-2016方法的定量限 (15 μg/kg)。
加标回收率和精密度选择凉皮作为检测基质，分别将加标浓度设置为 10、20、100 μg/kg，且每个加标浓度设 6 个平行样，通过基质标样单点校正进行定量。所得加标回收率和相对标准偏差 (RSD) 结果见表 2。从表中可以看出，未经脂肪去除净化时，凉皮基质中米酵菌酸的平均加标回收率和相对标准偏差分别为 98.8%–102.4%和 1.7%–3.5%；经过 QuEChERS 分散式 SPE 净化处理后，凉皮基质中米酵菌酸的平均加标回收率和相对标准偏差分别为83.3%–103.3% 和 0.6%–4.3%，均有良好的准确度和精密度。通过两种处理方式所得到的凉皮基质空白、标样和加标样品叠加色谱图见图 4。由图中可以看出，经过 QuEChERS 基质分散净化包处理后，获得了更出色的净化效果，空白基线噪音明显降低。
结论本应用采用高灵敏度的 Agilent 6470 三重四极杆液质联用系统(LC-MS/MS)，通过 Poroshell 120 EC-C18 色谱柱使米酵菌酸获得了良好的峰形并与其他基质组分得到有效分离。该方法针对未加油的凉皮或其他不含油的食品基质，使用 5% 甲酸乙腈直接提取盐析萃取、过膜后上机检测；对于含有一定油脂的样品，在提取后使用 Agilent Bond Elut QuEChERS 分散式 SPE 试剂盒实现快速、高效的净化，以减少对仪器的污染并延长色谱柱使用寿命。与现行国家标准方法中的样品前处理过程相比，该方法更加简便、快速。在 2–100 ng/mL 的浓度范围内，米酵菌酸线性相关系数为 0.9998，表现出良好的线性；方法检出限为 5 μg/kg，定量限为 10 μg/kg，具有出色的灵敏度；在 10、20、100 μg/kg 的加标浓度下，直接提取与经过 QuEChERS 分散式 SPE 净化处理时，凉皮基质中米酵菌酸的平均加标回收率和相对标准偏差分别为83.3%–103.3% 和 0.6%–4.3%，均表现出良好的准确度和精密度。该方法适用于定量测定凉皮中的米酵菌酸。
