重组蛋白质治疗药物（例如单克隆抗体 (mAbs)）的体积排阻色谱法 (SEC) 是检测是否存在可能对安全性和有效性产生不利影响的大小异构体的重要分析工具。SEC 通常使用非挥发性磷酸盐缓冲液，这使得分离过程与质谱 (MS) 不兼容。因此，峰鉴定需要进行脱盐（在线或离线）。实验已证明，由于非特异性相互作用，当应用于经典的不锈钢仪器/色谱柱配置时，与 MS 兼容的挥发性缓冲液（如乙酸铵）的分离度明显低于磷酸盐缓冲液。这些非特异性相互作用可通过使用生物惰性或生物兼容性流路来抵消。安捷伦应用工程师近期工作显示带PEEK内衬的 Agilent AdvanceBio SEC 色谱柱与 Agilent 1290 Infinity II 生物液相色谱系统组合非常适合用于蛋白治疗药物的非变性 SEC/MS 分析。
为评估 SEC 流路中是否存在不锈钢组件的影响，采用几种系统或色谱柱组合对 mAb 样品进行分析。结果显示磷酸钠在所有测试组合中均提供了令人满意的分离性能，HMW 物质的回收率良好。当用乙酸铵代替磷酸钠并降低流动相离子强度时，在流路中存在不锈钢组件的情况下，分离效果会受到不利影响。色谱柱硬件的影响使得不锈钢色谱柱与作为流动相的乙酸铵配合使用时，几乎无法检出 HMW 物质（如有）。当安装带 PEEK 内衬的色谱柱并使用 100 mM 乙酸铵运行时，HMW 物质重新出现。使用 50 mM 乙酸铵流动相（在 MS 灵敏度方面最有利）时，只有生物兼容性液相色谱系统与带 PEEK 内衬的色谱柱的组合（右下色谱图）能够检出 HMW 杂质，提供有用的结果。
图 2. 使用不同流动相组成和不同惰性程度的硬件得到的曲妥珠单抗的 UV 280 nm SEC 色谱图
图 4 进一步示出仪器对峰宽和拖尾的影响。当应用 1290 Infinity II 生物液相色谱系统时，峰宽始终较小。将磷酸盐流动相替换为与 MS 兼容的乙酸盐后，峰拖尾也不会增加。另一方面，当不锈钢液相色谱系统上的流动相改变时，峰宽和拖尾都会受到严重影响。降低流动相的离子强度会放大这种效应。
图 4. 在使用 Agilent 1290 Infinity II 液相色谱系统 (SST LC) 和 Agilent 1290 Infinity II 生物惰性液相色谱系统以及不同的流动相组成获得的曲妥珠单抗和 NISTmAb 的 UV 280 nm SEC 色谱图中观察到的峰宽和拖尾
1290 Infinity II 生物液相色谱系统与带 PEEK 内衬的 AdvanceBio SEC 色谱柱（使用乙酸铵）相结合的出色性能，为搭配Agilent 6545XT Q-TOF 直接进行非变性 MS表征提供了可行性。为平衡色谱性能与 MS 灵敏度，选择 100 mM 乙酸铵流动相。
图 6 显示了维布妥昔单抗（一种半胱氨酸偶联的 ADC）的 SEC/UV/MS 分析结果。由于轻链和重链仅由非共价相互作用维持，因此如果使用传统的反相变性条件进行质谱表征是很难获得完整蛋白水平数据。使用Native SEC-MS进行表征，解卷积的谱图显示了药物分布和药物/抗体比率 (DAR)，以及主要的糖型信息。
图 6. ADC 维布妥昔单抗的 SEC/UV/MS。(A) UV 280 nm 色谱图，以及 (B) 与单体峰相关的解卷积非变性质谱图，显示药物分布为 0 到 8 且 DAR 为 4
结论
当使用非变性 SEC/MS 分析 蛋白治疗药物时，不能低估液相色谱仪器和色谱柱惰性的重要性。减少与流路中不锈钢组件的非特异性相互作用，对于确保获得足够的色谱性能和 HMW 物质的回收率至关重要。配备有 PEEK 内衬的 Agilent AdvanceBio SEC 色谱柱在 Agilent Infinity II 生物液相与6545XT Q-TOF系统上，能够实现出色的非变性 MS 检测。
“码”上领取
即可免费下载安捷伦采用完全生物兼容性流路对 mAbs 进行非变性 SEC/MS 分析应用简报。
