TR-FRET热门应用介绍——药物研发如虎添翼

TR-FRET（Time-Resolved Fluorescence Resonance Energy Transfer，时间分辨荧光共振能量转移）是一种用于研究分子间相互作用的生物物理技术。它结合了两种技术：荧光共振能量转移(FRET)和时间分辨荧光（TRF，Time-Resolved Fluorescence）。荧光共振能量转移是一种物理现象，其中一个荧光分子（供体）在吸收光能后，可以将激发能量非放射性地传递给另一个分子（受体），如果受体在空间上足够接近供体（通常在1-10nm范围内）。这种能量转移的效率与供体和受体之间的距离的六次方成反比，因此可以用来研究分子间的接近程度和相互作用。时间分辨荧光(TRF)是一种测量荧光寿命的技术，它通过在停止激发光源后测量荧光衰减来区分短寿命的背景荧光和长寿命的信号荧光。这允许在激发后的一个特定时间窗口内测量荧光，从而减少背景干扰，提高信号的信噪比。利用这项技术可以高效筛选靶向蛋白/蛋白受体抑制剂、筛选靶向蛋白降解的PROTAC分子、筛选KRAS/cRAF小分子阻断剂等。

荧光共振能量转移原理图

时间分辨荧光原理图

细胞因子/细胞因子受体阻断剂筛选

细胞因子抑制剂类药物在医学界的应用和研究领域显示出广泛的潜力，特别是在治疗自身免疫性疾病、肿瘤、感染和其他多种疾病方面。

在自身免疫性疾病治疗方向， IL-2和IFN是治疗自身免疫性疾病的重要细胞因子抑制剂。IL-2已被广泛研究用于治疗多种自身免疫性疾病，尽管其开发受到挑战，但仍然是治疗这些疾病的关键药物之一。IFN-α主要用于治疗病毒性感染和肿瘤，其对慢性活动性肝炎和毛细胞白血病的疗效较为显著。最近，针对B淋巴细胞刺激因子(BLyS)的抑制剂（如贝利尤单抗）已在中国获得上市批准，另有20多种药物正在积极开发中，用于治疗类风湿关节炎等其他自身免疫性疾病。IL-1受体拮抗剂在治疗炎症和自身免疫性疾病方面显示出较好的疗效。

在肿瘤治疗方向，抑制肿瘤细胞中的特定细胞因子信号通路是当前肿瘤治疗的策略之一。例如，抗TNF单克隆抗体在肿瘤治疗中的应用，以及利用PD-L1/IL-15 Immunocytokines治疗肿瘤的新型疗法正在发展中。小分子蛋白质-蛋白质相互作用抑制剂，这类药物能够抑制细胞内的信号传导，用于癌症治疗，特别是通过抑制关键的信号分子如STAT3来阻断肿瘤信号通路。另外，CDK4/6抑制剂在乳腺癌治疗中显示出潜力，已有三种药物获批用于治疗激素受体阳性乳腺癌患者。

感染和炎症性疾病治疗方向，抑制炎症反应的细胞因子产生和受体结合是治疗感染性休克和自身免疫性疾病的有效方法。

细胞因子抑制剂类药物在多个疾病的治疗中显示出显著疗效，但也面临着副作用大、耐药等挑战。随着新技术和新药物的开发，未来可能会有更多选择和更好的疗效。

图1 TR-FRET技术用于筛选细胞因子阻断剂原理模型一

如图所示，Tag1与Tag2之间的相互作用是通过使用Eu标记的抗Tag1抗体（TR-FRET供体）和Accepter标记的抗Tag2抗体（TR-FRET受体）检测的。由于Tag1与Tag2结合介导供体抗体与受体抗体接近，供体抗体的激发会触发向受体抗体的荧光共振能量转移(FRET)，使受体抗体特异性发射665nm波长的信号。该特定信号与Tag1与Tag2相互作用的程度成正比。该均相实验操作简单，无需洗涤步骤。

图2 TR-FRET技术用于筛选细胞因子阻断剂原理模型二

如图所示，Tag1与Tag2之间的相互作用是通过使用Eu标记的抗Tag1抗体（TR-FRET供体）和Accepter标记的Tag2蛋白（TR-FRET受体）检测的。由于Tag1与Tag2结合介导供体抗体与受体抗体接近，供体抗体的激发会触发向受体抗体的荧光共振能量转移(FRET)，使受体抗体特异性发射665nm波长的信号。该特定信号与Tag1与Tag2相互作用的程度成正比。该均相实验操作简单，无需洗涤步骤。

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数据展示：以下数据不能代替实验中获得的数据，只作为示例，结果可能因TR-FRET兼容仪器而异。

1、TNF-a & TNFR1 Binding

2、TNF-a & TNFR2

3、IL-2 & IL-2R

4、IL-3 & IL-3R

5、IL-4 & IL-4R

6、IL-17 & IL-17RA

靶向蛋白降解的PROTAC分子筛选体系

PROTAC（Proteolysis Targeting Chimeras）是一种利用细胞内的泛素-蛋白酶体系统来选择性降解靶蛋白的新兴药物设计策略。近年来，随着对PROTAC技术的不断发展，它的应用已远远超越了最初针对癌症治疗的范围，拓展到了包括免疫疾病、神经退行性疾病、心血管疾病、感染性疾病等多个领域。

在癌症治疗方向，PROTAC技术在癌症治疗方面取得了显著进展。例如，ARV-110作为靶向雄激素受体(AR)的口服小分子PROTAC，已进入了治疗转移性去势抵抗性前列腺癌的I期临床试验。针对非小细胞肺癌的研究中，出现了具有高效力的PROTAC分子，并在体内外及体内实验中显示出良好的疗效。另外，针对EGFR的PROTAC分子也在非小细胞肺癌的治疗中显示出优势。传统的靶向疗法常常因靶蛋白的突变或过表达而导致耐药，PROTAC技术通过降解而不是简单抑制靶蛋白，显示出克服这些耐药机制的潜力。例如，针对癌症治疗中常见的耐药问题，PROTAC提供了一种新的治疗选择。

PROTAC技术不仅限于癌症治疗，还在其他多种疾病中显示出应用前景，如心血管疾病、神经疾病、代谢性疾病等。例如，利用PROTAC技术开发的ER靶向口服药物ARV-471，在治疗ER阳性、HER2阴性乳腺癌的临床试验中展现出潜力。该技术允许针对那些传统认为“不可成药”的靶点进行药物开发，为药物发现提供了新的途径。例如，针对激酶抑制剂的非特异性和耐药问题，PROTAC提供了一种新的解决方案。

PROTAC技术引起了学术界和工业界的广泛关注，显示出在药物开发方面的巨大潜力。但仍面临诸多挑战，如如何提高其细胞内外的稳定性和细胞渗透性，以及如何克服由此引起的潜在副作用。总结来说，PROTAC技术通过其特殊的作用机制，为多种疾病的治疗提供了新的可能，尤其是在克服传统药物的局限性方面展现出优势。

图3 TR-FRET技术用于筛选PROTAC分子技术原理模型

如所示，Tag1与Tag2之间的相互作用是通过使用Eu标记的抗Tag1抗体（TR-FRET供体）和Accepter标记的抗Tag2抗体（TR-FRET受体）检测的。由于分子胶PROTAC介导了Tag1与Tag2 的相互作用，供体抗体与受体抗体接近，供体抗体的激发会触发向受体抗体的荧光共振能量转移(FRET)，使受体抗体特异性发射665nm波长的信号。该特定信号与PROTAC和Tag1/Tag2的相互作用的程度成正比。该均相实验操作简单，无需洗涤步骤。

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数据展示：以下数据不能代替实验中获得的数据，只作为示例，结果可能因TR-FRET兼容仪器而异。

1、DDB1/CRBN & BDR4，Protac : BET Degrader-1

2、DDB1/CRBN & GSPT1，Protac : CC-885

KRAS/cRAF小分子阻断剂筛选体系

KRAS蛋白是一种GTP酶，其功能是将GTP水解为GDP，这是细胞内信号传导过程中的一个重要步骤。KRAS蛋白是RAS家族的一员，是肿瘤发生中最常见的突变基因之一，约占人类肿瘤的20-25%。它在多种癌症类型中都有突变，包括肺癌、结直肠癌和胰腺癌。KRAS蛋白的突变通常会导致其持续激活，从而引发多种癌症信号传导途径，促进癌细胞的增殖、存活和转移。

KRAS蛋白的突变有不同的亚型，包括G12C、G12D和G12V等，其中G12C突变是最常见的。针对KRAS G12C突变的小分子抑制剂已经进入临床试验，并且在非小细胞肺癌和结直肠癌患者中显示出潜在的治疗效果。

MRTX1133是由Mirati Therapeutics开发的一种小分子抑制剂，它针对的是KRAS G12D突变体，这是最常见的KRAS突变形式，在多种实体瘤中具有广泛的存在，尤其是在胰腺导管腺癌(PDAC)中，约93%的病例存在KRAS突变，其中G12D和G12V是很普遍的。MRTX1133是shou个非共价、强效且选择性的KRAS G12D抑制剂，具有较好的临床表现。

该实验使用Europium-labeled anti-6xHis和Acceptor-labeled GST检测不同突变的Kras蛋白和cRAF(RAF1)蛋白间的相互作用，MRTX1133从300nM进行2倍梯度稀释，孵育1h后检测信号。 数据显示出较好的S/B窗口（~7倍），较高灵敏度及一定选择性（G12D IC50最小）。

图4 TR-FRET技术用于筛选KRAS/cRAF小分子阻断剂技术原理模型

如图所示，KRAS WT/GTP/cRAF的相互作用是通过使用Eu标记的抗Tag1抗体（TR-FRET供体）和accepter标记的抗Tag2抗体（TR-FRET受体）检测的。由于KRAS WT/GTP/cRAF相互作用，供体抗体与受体抗体接近，供体抗体的激发会触发向受体抗体的荧光共振能量转移(FRET)，使受体抗体特异性发射665nm波长的信号。该特定信号与KRAS WT/GTP/cRAF的相互作用的程度成正比。该均相实验操作简单，无需洗涤步骤。

已上线产品试剂盒

数据展示：以下数据不能代替实验中获得的数据，只作为示例，结果可能因TR-FRET兼容仪器而异。

1、KRAS WT & cRAF Binding, Inhibitor : MRTX1133

2、KRAS G12C & cRAF Binding, Inhibitor : MRTX1133

3、KRAS G12D & cRAF Binding, Inhibitor : MRTX1133

4、KRAS G12V & cRAF Binding, Inhibitor : MRTX1133

5、KRAS G12R & cRAF Binding, Inhibitor : MRTX1133

6、KRAS G13C & cRAF Binding, Inhibitor : MRTX1133

7、KRAS G13D & cRAF Binding, Inhibitor : MRTX1133

8、KRAS Q61H & cRAF Binding, Inhibitor : MRTX1133

参考文献：

[1] Small Molecule Protein–Protein Interaction Inhibitors as CNS Therapeutic Agents: Current Progress and Future Hurdles.Richard R Neubig; Levi L Blazer

[2] Effects of 17-DMAG on non-small cell lung cancer cell lines A549 and H1975 being resistant to EGFR-TKI.Zhao, Lei; Cao, Fumin

[3] Latest Overview of the Cyclin-Dependent Kinases 4/6 Inhibitors in Breast Cancer: The Past, the Present and the Future.Zhang, Wei; Chen, Xiu; Xu, Weilin ; et al.

[4] Proteolysis targeting chimera (PROTAC) in drug discovery paradigm: Recent progress and future challenges,Zeng, Shenxin; Huang, Wenhai; Liyan Cheng; et al.

[5] Overcoming Cancer Drug Resistance Utilizing PROTAC Technology.Zheng, Guangrong; Burke, Matthew R; Smith, Alexis R

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