小鼠胚胎成纤维细胞分离、培养及鉴定教程
一：细胞简介
小鼠胚胎成年维细胞常用作ES细胞培养常用的饲养层细胞，能产生抑制ES细胞自主分化和促进ES细胞增殖的因子，故能有效地促进ES细胞的增殖井维持其示分化特性和多潜能性，
且分泌效果优于外源添加的一些因子而且可以为ES细胞的培养提供类似于体内的微环境故在研究哺彩L动物ES细胞中得到广泛使用。
二：实验准备
提前准备好将要用到的工具、试剂：无菌枪头、无菌EP管、小鼠胚胎成纤维细胞专用培养基、胚胎成纤维细胞组织分离液、胚胎成纤维细胞
基础培养基、HBSS缓冲液。
三：实验步骤
取孕13.5天小鼠,断颈处死，置于体积分数为75%酒精消毒3 min无菌打开孕鼠腹腔可见腹腔两侧呈“V”字型串珠样子宫。用镊子提起子宫（
注意:不能碰到皮毛，以防污杂）并用眼科剪去除子宫系膜和结缔组织，将子宫放入含有HBSS的一次性无菌培养皿中漂洗两三遍去除淤血，
用眼科剪和镊子去除胎盘、手膜等胚胎外组织，取出胚胎放入另一平皿用HBSS洗涤，直到没有血迹为止。用眼科剪和镊子去除胚胎的头部、
四肢及内脏，留取躯干部（头部、四肢及内脏需去除干净）将躯干部放入玻璃平皿中用HBSS洗涤1次，用眼科剪将胚胎躯干部剪碎成糊状加入
5mL HBSS混勿移入离心管中，自然沉降3min后将上清液轻轻吸出弃掉加入3mL 组织分离液轻轻吹打后室温下自然沉降2min，
将上清液轻轻吸出弃掉加入3mL 组织分离液轻轻吹打后室温下消化3min，将上部的单细胞悬液轻轻吸出放入另一个离心管中加等量小鼠胚胎
成纤维细胞专用培养基终止消化，重复消化两次若还有未消化的组织再加入2 mL组织分离液轻轻吹打至消化。终止消化，
混匀离心管收集所有细胞悬液自然沉降1min，将大块沉淀吸出弃掉800转每分钟离心5mi弃去上清，
使用小鼠胚胎成纤维细胞专用培养基重悬至5 mL吸取细胞溶液，加入台盼蓝进行计数按5x106/瓶接种到T25培养瓶中补足体积分数为小鼠
胚胎成纤维细胞专用培养基记为原代（PO）摇晃混匀，在37℃、体积分数为5%二氧化碳的培养箱中培养，24h后换液。
细胞鉴定
24h后可见绝大部分贴壁细胞呈成纤维细胞样，细胞体积较小，杂细胞较少，30min细胞贴壁，其中部分开始伸出伪足，表现为小的突起，6h后细胞基本贴壁，伸展成梭形，胞核清晰，分布较均匀，散在生长，不聚集成团；分布较均匀，散在生长，不聚集成团，细胞生长迅速，
5-7天即呈融合状态，细胞排列紧密，有的交叉重叠生长，平坦、胞体较大，细胞质透明，细胞核较大，呈椭圆形，颜色淡，细胞融合，
并彼此连接成网状，细胞呈突起的纺锤形或星形的扁平分布。细胞呈突起的纺锤形或星形的扁平分布，细胞呈突起的纺锤形或星形的扁平分
布，小鼠胚胎成纤维细胞经Vimentin免疫荧光鉴定纯度可达90%以上
