基于温度的药品冻融操作过程表征

基于温度的药品冻融操作过程表征

在生物制药生产过程中，冻融操作用于确保长时间保存期间产品的完整性，但它们也会引入额外的压力，例如可能导致蛋白质活性丧失的冷冻浓度梯度。 应对不同规模的冻融操作进行工艺表征，并注意冷冻时间和边界效应，以确保产品在整个工艺和工艺开发过程中的稳定性。 目前，过程表征通常依赖于一个或很少的温度探头，这些探头根据原始温度检测凝固时间，而原始温度在很大程度上受到浓缩溶液冰点降低的影响。 为了克服这个问题，提出了一种基于光纤布拉格光栅传感器温度测量的二阶导数来检测结冰的方法。 该方法的适用性通过使用纯化水和浓缩制剂的冷冻时间来最小化边界效应的新型小型冻融装置的过程表征来证明。 对于 -60 至 -20℃ 的温度，冷冻时间从 35 分钟到 81 分钟不等，并影响冷冻浓度曲线。 此外，基于普朗克方程的冻结时间估计揭示了由于启动温度梯度而导致的模型局限性，这可以通过经验扩展的普朗克模型来纠正。 作为假设，我们得出的结论是，从冷冻浓度的角度来看，冷冻温度对于冷冻袋等特征冷冻距离较小的容器来说不太重要。 使用二维解析温度曲线，当冷冻温度高于 -30℃ 时，观察到最后一个冷冻点从容器顶部到底部的移动。

关键词：冻融，过程表征，冷冻时间，配方，最后冷冻点

介绍

治疗性蛋白质是畅销的药物之一。 由于其高价值和生产成本，活性药物成分 (API) 在运输和储存过程中的活性损失必须通过选择合适的制剂试剂来限制 (Chang et al., 2005; Bauer et al., 2017)和储存 状况。 因此，许多生物药品都以冷冻状态储存(Singh et al.,2009;Authelin et al., 虽然冷冻会减慢并减少 API 的降解反应，但冷冻过程会使蛋白质面临不同的压力，例如冷变性（Privalov，1990）、冷冻浓缩(Bhatnagar et al., 2007)、冰晶形成（Chang et al.， 1996），以及潜在的赋形剂结晶。 蛋白质活性损失或聚集与冷冻浓度相关（Reinsch et al.，2015；Roessl et al.，2015）。 在微观尺度上，水分子的结晶导致冰晶结构内剩余溶质的冻结浓缩，从而导致蛋白质的冻结温度依赖性相行为（Wöll et al.，2019a，b）。 在大规模冷冻操作中，宏观冷冻浓缩导致溶质分布不均匀。 在冷冻较大体积的过程中，冰锋从冷却的容器壁向容器的中心前进。 冷冻时，溶质浓缩在相边界前面并在固相和液相之间分配（Bhatnagar et al.，2007），导致宏观冷冻浓缩。 此外，由于密度梯度，这种冷冻浓缩效应会导致自然对流（Butler，2002），从而导致溶质沉降。 因此，随着冻结前沿的出现，峰值浓度出现在冻结体中心底部的非典型冻结浓度分布是不可避免的（Maity et al.,2009;Kolhe and Badkar,2011;Roessl et al.,2014; Reinsch et al.，2015）。

缩写：LPTF，最后一个冻结点； PTFE、聚四氟乙烯； RMSE，均方根误差； TRIS，三-（羟甲基）-氨基甲烷

研究表明，冷冻浓度取决于冷冻过程而不是储存温度（Hauptmann et al.,2019）。 然而，缺少以传热和相变为重点的冻融特性研究（Fan et al., 2018），但对于确保工艺可扩展性并允许在理想冷冻温度方面进行工艺优化是必要的。 经常用于表征冻结过程的一个关键参数是冰锋速度，它影响最大冻结浓度（Webb et al.,2002；Rodrigues et al., 2011；Hauptmann et al., 2019）和总冻结时间。 冻结时间的确定通常基于最后冻结点 (LPTF) 的粗略温度测量，其中冰锋在冻结过程结束时聚集在一起。 该计算依赖于冰低于冰点温度的假设，由于冰点降低发生在高度浓缩的环境中，冰点温度通常在 -0.5 (Rodrigues et al., 2011) 到 -5℃ (Lashmar et al., 2007) 之间任意设定。 解决方案。 此外，温度探头必须准确位于 LPTF 位置。 尚未提出一种独立于凝固点降低和 LPTF 位置来确定凝固时间的方法。 在最近的一篇出版物中，建议使用 Plank 方程来模拟制药过程的总冷冻时间（Authelin et al.,2020），从而可以预测和优化过程时间。 然而，迄今为止，药物冷冻过程中的模型验证还缺失（Authelin et al.，2020）。

In the following work,a derivative-based temperature analysis for the detection of the total freezing time is presented. This method is used for process characterization of a novel small- scale freeze-thaw model with regards to freezing times at different temperatures. The applicability of the Plank equation on actively cooled pharmaceutical freezing processes is discussed to improve transferability of freezing processes to different scales and freezing setups. An extension of the Plank equation is introduced for correction of transient start-up conditions.

在接下来的工作中，提出了一种基于导数的温度分析来检测总冻结时间。 该方法用于对新型小规模冻融模型在不同温度下的冷冻时间进行过程表征。 讨论了普朗克方程在主动冷却药物冷冻过程中的适用性，以提高冷冻过程到不同规模和冷冻装置的可转移性。 引入普朗克方程的扩展来校正瞬态启动条件。

材料和方法

样品制备

所有使用的溶液均用超纯水（PURELAB Ultra、ELGA LabWater、Veolia Water Technologies，Saint-Maurice，France）制备，并在使用前使用 0.2 mm 过滤器进行无菌过滤。 由于 Tris-（羟甲基）-氨基甲烷 (TRIS) 缓冲液是蛋白质制剂中广泛使用的缓冲液（Zbacnik  et al., 2017），TRIS 缓冲液由购自 Merck（达姆施塔特，德国）的 TRIS 和 Tris-(羟甲基)- 制备而成。 氨基甲烷盐酸盐购自 AppliChem（达姆施塔特，德国），浓度为 500 mM。 使用盐酸将pH调节至pH 7.5±0.1。 选择具有单一成分的溶液以减少成分相互作用，并选择较高的浓度以更好地与通常冷冻运输的高浓度药物制剂进行比较。 此外，凝固点降低取决于溶质浓度，这强调需要新的总凝固时间计算方法。 对于蛋白质和稳定糖等不同的溶质，预计会产生类似的浓度效应(Rodrigues et al.,2011)。

新型小型冻融装置

与德国施韦青根 Bilfinger Industrietechnik Salzburg GmbH 共同设计和制造了一种新型小型冻融装置。 它被设计为工业规模冷冻装置的缩小模型，代表较大中空管的切片。 如图 1 所示，中空圆柱形冷冻装置由外冷却套和内冷却管冷却，而底部单独加热，以最大限度地减少缩小边界效应。 容器体积被聚四氟乙烯 (PTFE) 制成的镶嵌物分为六个单独的室。 该嵌体允许在每个室高达 90 mL 的工作体积下执行最多六个单独的实验。 此外，由于导热率低，PTFE 还可以平衡腔室底部的热通量，从而产生如图 1 横截面所示的温度分布。该 PTFE 底部抵消了由于钢的导热性而出现的边界效应 墙壁。 外冷却壁和内冷却壁由 3 毫米厚的 316L 不锈钢制成，半径分别为 38 毫米和 100 毫米。 腔室深度为 40 毫米。 所有管道和钢制部件均使用 Armacell（德国明斯特）的 20 mm Armaflex 进行绝缘。

冻融装置的管道和仪表图如图 1 所示。为了达到所需的温度，装置的内部和外部冷却回路合并并连接到带有冷却液 Kryo 的低温装置 Integral XT 1590 90，均购自 Lauda（Lauda-Königshofen，德国）。 安装了 Krohne（德国杜伊斯堡）流量计、针阀和 2 bar 的设定系统压力，在内回路和外回路中实现了 25 ± 5 L/min 的冷却液流量。 容器底部由冷却装置 F25-MC 和冷却液 Thermal HY 加热，两者均购自 Julabo（德国 Seelbach）。 在初步研究中，当冷冻双去离子水时，发现 0℃ 的恒定底部温度对于容器中平行冷冻前沿所指示的最小边界效应是理想的（数据未显示）。 所有装置均以最大功率运行，没有任何设定的温度梯度。 连接到 Ahlborn（Holzkirchen，德国）数据记录器 ALMEMO 8590 的 PT100 热电偶在线测量分流前冻融装置入口处以及内回路和外回路两个出口流处的冷却液温度。 该设置允许设定温度为 -60 至 30℃。 使用 Mathworks（美国马萨诸塞州纳蒂克）使用 MATLAB App Designer 设计的自定义应用程序收集和控制测量数据。 该应用程序自动从数据记录器、两个冷却装置和上述样品温度装置在线收集和设置所有温度数据。 在下面的章节中，冷却温度Tcooling是指Kryo 90冷却单元的温度，而所有实验的底部温度均设置为0℃恒温。 流体温度T∞是指在低温装置入口处测得的温度。 设定温度Tset是冷却后在冷却单元(Tcooling)中达到的温度。

图 1 | 实验装置。 显示了带有两个单独的冷却单元来控制冷冻室的低温装置的管道和仪表图。 冷冻室可视化为小型冻融装置的横截面。 冷却液和 PTFE 嵌体的温度分别用蓝色到红色从 Tset 到 0℃ 的梯度表示。 在横截面内部，样品温度探头和尺寸（以毫米为单位）显示为白色弯曲钢封装上的灰点。 管道由箭头表示。 阴影区域表示实心不锈钢和 PTFE。

在进行实验之前，使用 Otto-chemie（德国弗里多芬）的食品级硅胶 Ottoseal S27 密封 PTFE 嵌体和外壳之间的间隙。 对于每个实验，将 90 mL 样品移入腔室中。 相邻的室充满超纯水，以尽量减少径向边界效应。 冷冻过程开始时在 5℃ 下保持至少 2 小时，以确保平衡起始条件。 平衡后，在最大冷却坡度下将设定温度调整为-60 至-20℃。 当所有样品温度传感器测得温度低于-1℃后，底部加热装置自动关闭以达到低样品温度。 如果采取冷冻样品，则在冷冻后增加 2 小时的保持时间，以确保冷冻过程处于平衡。 冷冻步骤后，通过将温度设置为30℃至少1小时来开始解冻。 不同阶段的计时是使用上述应用程序自动完成的。

温度评估

使用 14 个温度传感器监测样品温度，如图 1 所示，并提供探头坐标信息。 传感器位于 Loptek（德国柏林）定制设计的两根预先校准的光纤温度光纤上，以及来自 Sylex（斯洛伐克布拉迪斯拉发）的询问器 SCN-46 S-line Scan 416。 这些光纤被直径为 1 毫米的不锈钢管封装，并包含多达九个光纤布拉格光栅传感器。 一根带有六个传感器的光纤位于样品表面下方 5 毫米处，另一根带有八个传感器的光纤位于腔室地面上方 5 毫米处，以实现腔室横截面的二维解析温度场。 使用 Sylex（斯洛伐克布拉迪斯拉发）的 S-line Sentinel 软件每 2 秒获取一次温度数据。 与常用的热电偶相比，所使用的温度监测装置具有提高温度分辨率的优点，同时减少通过传感器电缆的热传导。 我们预计沿传感器的热传导不会影响冷冻过程，因为与周围的冰和水相比，1 毫米厚的中空管的热容量可以忽略不计。

图 2 | 过程温度评估示例。 (A) 显示测量的器件温度 Tout、T∞ 和 T Cool 以及 13 个样本温度中的 5 个。 菱形表示冷却时间，三角形表示单个探针处的冻结，六边形表示 LPTF。

各个探针处的冻结和 LPTF 时间是根据样本数据二阶导数的最小值计算的，如面板 (B) 所示。 r表示温度探头距冷却表面的距离增加。 各个样品温度曲线在面板 (B) 中进行了着色，以提高可见性。

查看如图 2A 所示的典型样品温度曲线，可以检测到两个不同的相变时间。 第一个转变发生在观察到的温度探针处冻结时，其中温度降至熔点以下，称为部分冻结时间。 此时，热力学性质从水变为冰，导致温度斜率发生明显变化。 第二个事件表示 LPTF 冻结，称为总冻结时间。 当整个块体被冷冻时，不再释放潜热，因此所有探头的温度将同时降低。 为了分析每个温度探头测量的两次时间，使用 Savitzky-Golay 滤波器对温度曲线进行平滑和导出两次，并使用二阶多项式和 151 个数据点的窗口。 二阶导数的最小值表示所讨论的斜率变化。 应根据稍后讨论的数据质量仔细选择滤波器窗口，其中较小的窗口会导致更高的精度，但也会导致更高的信噪比。 冻结时间是根据所有 14 个温度测量值计算的，并删除了基于三个缩放中值绝对偏差的异常值，以提高计算的稳健性。 然而，由于所用光纤传感器的信噪比较低，部分冻结时间是根据低于 -2℃的温度确定的。 当将该方法应用于热电偶的温度读数时，可以基于具有较小萨维茨基-戈莱过滤器窗口的二阶导数来分析部分和总冻结时间。

根据设定温度的低温度计算直到冷却液达到设定温度的冷却时间。

结冰时间预测

计算总冻结时间 tfreezing 的 Plank 模型（Plank，1913）由 Authelin 等人提出。 （2020）作为药物冷冻过程的模型。 它假设冷却流体温度 Tcooling 从平衡逐步降低到设定温度，并且在冻结之前主体处于熔化温度 Tm。 方程可以写成

其中ρl是液体样品的密度，Δhm是熔化潜热，X是LPTF和传热表面之间的特征距离（Pham，2005）。 对于无限板，几何因子 E 为 1，对于无限圆柱体，几何因子 E 为 2，对于球体，几何因子 E 为 3。 比奥数 Bi = kaX/λs 将壳的传热阻力 ka 与给定导热系数 λs 的样品的内部导热阻力联系起来（Martin，2010）。 对于药物溶液，可以在稀释溶液的假设下使用固体水作为溶剂的物理性质(Randall and Rossini, 1929; Kumano et al., 2007)。 假设平衡温度和熔化温度之间的温差可以忽略不计，并且壁温等于 T∞(Bi→∞)，这对于主动冷却的冷冻系统来说可能是这样，则冷冻时间可以使用方程 2 来计算。

其中 oC·min 中的 β 是 ρl 、Δhm、X2 、λs 和 E 的函数，总结了给定主动冷冻系统的所有常数值。

冷冻散装分析

使用来自 Bürkle（德国巴特贝林根）的内径为 8 毫米的空心钻头从冷冻块中取样。 将一个 3D 打印支架放置在腔室顶部，该支架以 10.5o 的角度分布在两排不同的行中，具有 9 个钻孔，从而在整个腔室长度上提供可重复的钻孔位置。 在径向边界效应可忽略不计的假设下，从具有重叠样本体积的两个不同行进行采样提高了横截面的样本分辨率，如图 1 中的实线和虚线所示。 从三层 8 毫米高的钻孔中取样，最后一个孔距室底部 2 毫米。 始终丢弃高于第一样品水平的样品，以避免吸收先前钻孔和测量来自腔室中心的冷冻浓缩液体的冰碎片，该冰碎片被推出膨胀的冰锋相遇的地方。 将样品转移至来自 Eppendorf（德国汉堡）的 2 mL 反应管中并在室温下解冻。 使用来自Radiometer Analytical SAS（法国里昂）的电导率计CDM 230通过电导率分析来测量样品的缓冲液浓度。

结果

冻结时间分析

为了表征和描述冷冻过程，总冷冻时间是一个关键的过程参数。 总冻结时间可以根据二阶导数计算出来，如图 2 所示。虽然总冻结时间的最小值很明显，但部分冻结时间的最小值则不然。 当冷冻温度高于-25℃时，由于温度传感器的信噪比较低，所有温度探头都无法正确检测到第一个最小值。 因此，当温度低于 -2℃ 时确定部分冻结时间。通过各个探头的冻结时间，可以监测室内冰锋进展，如图 3 所示。根据二阶导数计算的总冻结时间 所有温度曲线的结果是纯水样品的标准偏差低于 2%，高浓度缓冲液样品的标准偏差低于 4%。 查看图 2A 中所示的观察到的过程温度，由于温度调节，冷却温度超过设定温度最多 3 K，而由于钢外壳的热容量，流体温度却没有超过设定温度。

过程表征

纯化水在不同温度下冷冻，以表征新型冻融装置的传热性能，因为它可用于大规模工艺表征。在我们的研究中，当设定温度从-20℃降低到-60℃时，水样的总冷冻时间缩短了2.3倍，从78.7分钟缩短到33.8分钟，如图4所示。与在较低冷却温度下几乎停滞的冷冻时间减少相比，在较高冷却温度下冷冻时间缩短得更快。基于方程2，使用-25至-20℃的数据拟合了估算模型，得出β值为1619 C·min，R2=0.972。用-20℃下的数据求解方程2，得到β=1620 C·min。计算出模型和所有设定温度的均方根误差（RMSE）为1.83分钟，其中在-25℃以下的温度下测量的冷冻时间总是超过估计的冷冻时间。根据方程3计算冷却时间与总冷冻时间的比值Ⅱ。从总冷冻时间中减去经验确定的17.3倍Ⅱ，RMSE降低到0.96分钟，特别是在较低温度下冷冻时间的估计得到了改进，如图4所示。

分析冷却装置内传热流体的温度，测得设定温度为—30℃及以上时冷却时间为4.2-4.9分钟。 对于较低的设定温度，冷却时间大大增加。 冷冻过程开始后，冷却液与低温装置出口之间的温差高达 3 K，在平衡状态下降至 0.5 K 左右。 使用供应商提供的传热流体的平均热容为 1.5 kJ/kg/K、密度为 900 kg/m3、流量为 25 L/min，可估计功率损耗为 330 至 100 W 处于平衡状态。

样品温度

在温度纤维的帮助下，可以观察到连续的二维解析温度场，如图3所示。假设冷冻样品的温度低于-2℃，则在冷冻过程中可以观察到冰锋进展。 当冷冻 500 mM Tris 缓冲溶液时，观察到垂直冷冻前沿，如图 3A 所示。 在所有实验中，LPTF 都是在距内冷却壁 26.5 ± 2.5 mm 的距离处观察到的。 相反，LPTF 的垂直位置随温度变化，如图 3B 所示。 在设定温度低于-25°C的实验中，冷冻前沿首先在容器底部相遇，并且从容器底部到顶部有一个小间隙结冰，导致LPTF位置位于室的顶部。 当水分子的膨胀将液体推向主体表面时，就会发生这种情况，这与在 LPTF 位置处的样品主体顶部观察到的冰山一致。 在-25℃及以上的高温设定下冷冻会导致容器底部出现LPTF位置，其中剩余的液体以收缩钟的形式冻结。 图 3C 显示了基于温度的容器顶部和底部的总冷冻时间与根据温度斜率计算的总冷冻时间的比较。 基于斜率的冷冻时间与图 2 所示的纯化水观察到的相似。当设定温度低于 -25℃ 时，冷冻容器顶部和底部的冷冻时间差异微乎其微，而在设定温度下冷冻容器顶部和底部的冷冻时间差异高达 9.7 分钟。 更高的设定温度。

冷冻散装分析

将 pH 7.5 的 500 mM Tris 缓冲溶液在 -20、-40 和 -60℃ 下冷冻，以评估冷冻温度对冷冻浓度的影响，结果如图 5 所示。

在所有冷冻实验中，最大冷冻集中区域位于距离内冷却壁25mm的LPTF位置。 当温度从-60℃升高到-40℃再升高到-20℃时，最大冷冻浓度增量(cmax/c0)分别从1.39±0.01上升到1.52±0.03到2.53±0.04。 体积不均匀性，更具体地说是最大浓度与最小浓度的比率 (c max/cmin )，总结了冷冻浓度结果，高值代表高冷冻浓度。 当冷冻温度为-20、-40和-60 ℃时，将冷冻温度分别从8.1倍降低到3.6倍到3.0倍，体积不均匀性显着改善。 一般来说，观察到存在从上到下的浓度梯度。 作者想提一下，采样方法仅提供样品体积的平均浓度，而真正的局部峰值冷冻浓度预计会更高。

图 3 | 腔室横截面的二维解析温度分析。 (A) 显示插值温度数据，其中温度探头由矩形表示。 在下图中，低于 –1℃ 和高于 –1℃ 的温度分别用蓝色和红色突出显示。 面板 (B) 显示了 LPTF 之前的 –45 和 –20℃ 的突出温度。 (C) 不同设定温度下底部和顶部温度传感器的各个冻结时间的比较。 由温度斜率确定的 LPTF 时间绘制为条形图以供参考。

图 4 | 不同设定温度下的冷冻和冷却时间。 用星号标记的数据点用于根据方程校准模型。 2，β = 1619，其中灰色区域显示 95% 置信界限。

讨论

冻结时间分析

我们演示了一种从温度探头各个位置提取冻结时间以及从各种温度曲线的二阶导数中提取总冻结时间的方法。 单个探针冻结检测中的一个常见问题是冰点降低，这会导致诸如低于 -5℃ 的固态等假设（Lashmar 等，2007）。 此外，基于原始温度分布的总冻结时间的检测依赖于 LPTF 位置的知识。 我们通过使用温度二阶导数的方法克服了这两个问题。 然而，该方法依赖于冷冻温度和平衡温度差异较大的精确和高频数据。 随着冷冻温度升高，由于绝对温度梯度降低，信噪比降低。 因此，冷冻时间的标准偏差随着冷冻温度的升高而增加。 因此，通过斜率分析仅计算 LPTF 冻结时间。 用于计算容器顶部和底部冷冻时间的单独冷冻时间假设温度低于-2℃。

比较两种方法（如图 3C 所示）揭示了两种方法的偏差。 虽然基于导数的分析显示出与纯化水类似的趋势，但基于温度的分析通常会导致与预期冷冻时间的较大偏差。 尽管如此，基于温度的分析能够表明 LPTF 沉降到腔室的地面上，如下文所述。 当使用单个热电偶设计冷冻过程时，这一点非常重要，因为这应该针对 LPTF。 不幸的是，与普通热电偶相比，光纤温度传感器的信噪比通常较低。 然而，这显示了基于导数的方法的适用性和稳健性。

普朗克方程的推广

如上所示，冷冻温度的降低如预期缩短了总冷冻时间。 正如我们基于普朗克模型的模型所示，冷冻过程的热力学特性可以部分解释非线性趋势。 基于三个初始水冻结测试的计算模型能够估计较低温度下的总冻结时间。

然而，随着冷冻温度的降低，我们的实验结果与普朗克模型的偏差更大。 这些偏差显示了普朗克方程与过程相关的局限性。 与我们的模型不同，根据所有测量数据的指数外推，对于较低的冷冻温度，测量值预计接近约 31 分钟的最短冷冻时间。 由于普朗克方程仅适用于阶梯式冷却温度，因此随着温度降低而增加的冷却时间可以解释实际冻结时间的有限行为。

图 5 | 对温度范围为 –60 至 –20℃ 的冷冻钻芯进行离线样品分析。 样品体积在第一张图中以实线和虚线矩形显示，其中测量的中心用 x 标记。 标准化浓度通过从蓝色到红色的颜色梯度来可视化，并插值在三次重复的平均值之间 (n = 3)。

因此，引入无量纲数Ⅱ来考虑冷冻装置的瞬态启动条件。 对于理想系统，随着冷却温度逐步降低，II 接近 0，而在实际系统中，由于冷却装置中物理传热的限制，II 预计会随着冷冻温度的降低而增加。 如果超过 1，则降低设定冷却温度不会导致冷却时间进一步减少，因为初始瞬态期超过冻结时间。 因此，溶质的低温浓度也不会降低。 表 1 总结了我们设置的 Ⅱ 值。在较低设定温度下，随着需要从冷却液中去除更多的热函并且冷却装置在较低温度下效率降低，Ⅱ 会随着冷却时间的增加而增加。

TABLE 1 | Ⅱ values of the freezing device.表 1 | 冷冻装置的Ⅱ值。

通过计算出的 Ⅱ 值对冻结时间进行经验修正，显着改进了模型。 因此，我们得出结论，当考虑瞬态启动条件时，即使在低温下，普朗克方程也可以用于预测冻结时间。 此外，在进行结垢实验或比较不同冻融过程时，Ⅱ尤其重要。 一般来说，由于总冷冻时间短，对于冷冻袋等小冷冻距离容器来说，II 级被认为是最高的。 另一方面，被动冷却系统，如冻融瓶，由于其阶梯式冷却温度下降和较长的冷冻时间，将具有低的Ⅱ值。 因此，作者得出结论，从低温浓缩的角度来看，冷冻温度对于冷冻时间较长的系统（例如被动冷却系统和冷却容器）非常重要，Nidhi 等人也表明了这一点（Miller et al., 2013）。 相反，降低快速冷冻过程中的设定温度可能只能略微改善整体均匀性和蛋白质完整性，正如有关一次性袋冻融过程的报道(Kolhe et al., 2012; Le Saout et al.,2012;

作为一个应用示例，Plank 模型可用于在监管机构面前证明经过验证的可接受范围的合理性，其中较低的冷冻温度会导致更广泛的可接受范围，从而实现更稳健的过程。

样品温度

在我们的设置中观察到的冷冻过程中平行、垂直的冷冻前沿为我们的工艺的可扩展性提供了有价值的信息。 它强调了我们的设置中存在的最小边界效应，这对于小规模模型至关重要。 在边界效应不受控制的小规模过程中，例如瓶子中的被动冷冻，会发生从底部的冷冻，这可能会影响冷冻前沿形状和最终浓度分布，如 Kolhe 和 Badkar (2011) 所见，其中底部浓度通常较低 比上面的层。 在使用主动冷却系统的研究中，尚未描述边界效应。

观察到的另一个现象是，LPTF 距离内冷却壁更近，这是由于内壁传热面积较小的结果。 从内冷却壁到 LPTF 的体积以及从外冷却壁到 LPTF 的体积之间的简化能量平衡（参见补充材料）导致 LPTF 到内壁的理论距离为 24 mm，这与我们的研究结果一致。

当在高温下冷冻时，LPTF 明显下降到室的底部，这可以通过整个过程中冷冻浓缩液体的沉降来解释(Singh and Nema, 2010; Kolhe and Badkar, 2011)。 浓溶液推至 LPTF 顶部与 Hauptmann 等人的结果一致。 （2019）。 冷冻浓度导致溶液中产生粘度和密度梯度，从而引起自然对流（Butler，2002）。 此外，随着浓度的增加，冰点会降低。 因此，当冷冻浓度在升高的冷冻温度下时，LPTF 位置将下沉到底部。 由于对流增加（Authelin 等人，2020）和更大的沉降距离，这种效应在大规模应用中可能更加明显。 通常在 LPTF 处放置温度探头以进行过程监控(Lashmar et al., 2007; Le Saout et al., 2012)，这可能会在冷冻不同配方时导致错误结果。 因此，我们建议使用上面讨论的基于导数的方法来基于冷冻时间进行过程表征，因为该方法在容器中温度探头的位置方面具有灵活性。

冷冻散装分析

一般来说，我们的发现浓度最大值高达 2.5 倍，与主动冷却冷冻装置的文献一致（2002; Rodrigues et al., 2011; Reinsch et al., 2015)，他们报道了 1.3 至 2.5 -倍冷冻浓度。 观察到的浓度梯度可以通过溶质排除导致的冷冻浓缩来解释(Roessl et al., 2014; Authelin et al.,2020)和前面提到的较稠密冷冻浓缩物的沉降(Kolhe and Badkar,2011)。 在较低的冷冻温度下将温度降低 20℃ 时，体积均匀性的降低幅度较小，这可以归因于普朗克模型所见的物理限制，在较低温度下冷冻时间的缩短幅度较小。 这支持了我们的发现，即冷冻浓度和冷冻过程可以通过冷冻时间来表征，这与 Hauptmann 等人（2019）的观点一致。

结论

所提出的结果为冻融过程设计和监测提供了工业相关指导。 展示了一种使用两个独立冷却回路的新型冻融装置。 虽然该模型的工程复杂性有所增加，但它能够减少边界效应，例如从底部冻结。 因此，可以小规模评估工艺参数，例如 LPTF 的温度依赖性沉降，这对于工艺监控非常重要。 此外，将具有过程干扰的高分辨率温度监测方法与基于导数的方法相结合来计算总冷冻时间。 确定的冷冻时间对冷冻散装的冷冻浓度曲线有很大影响。 对于给定的主动冷却系统，可以使用普朗克方程通过模型校准和少量冻结时间实验来估计这些冻结时间。 然而，对于低冷冻温度下的实际过程，普朗克模型必须扩展无量纲数II，以考虑传热流体和系统冷却期间出现的启动条件。 Ⅱ可以解释为什么冷冻温度在短距离冷冻过程中起着更重要的作用。 因此，对于不锈钢容器中具有较大特征距离的冷冻过程，冷冻温度的降低可能对冷冻体积均匀性产生更大的影响。 冷冻距离较短的工艺（例如冷冻袋）可能不会因低冷冻温度而得到改善。 因此，这些发现对制药行业冻融操作的未来过程分析技术策略具有重大影响。