枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）凭借其生长迅速、遗传背景清晰、分泌蛋白能力强以及非致病性等诸多优良特性，已然成为工业微生物领域生产酶制剂、生物农药，以及生物技术范畴开展基因克隆、表达调控研究的热门宿主菌株。在现代生物技术蓬勃发展浪潮下，借助基因工程手段对枯草芽孢杆菌进行定向遗传改造，精准导入外源有益基因以拓展其功能特性，是挖掘其潜在应用价值的核心技术路径之一。
电转化法作为一种将外源 DNA 高效导入细菌细胞内的物理转化手段，在枯草芽孢杆菌基因操作中占据关键地位。其原理是基于高压电脉冲瞬间作用于细胞，致使细胞膜产生可逆性穿孔，形成短暂的跨膜通道，为外源 DNA 分子进入细胞内部创造契机。然而，该过程不可避免地会对细胞造成多重损伤，诸如电击致使细胞膜完整性破坏、细胞内电解质失衡、蛋白质变性以及核酸损伤等不良后果，这直接导致细胞存活率锐减、转化效率低下且重复性欠佳，极大限制了枯草芽孢杆菌基因工程改造的高效开展。
海藻糖（Trehalose），作为一种由两分子葡萄糖通过 α,α-1,1 - 糖苷键连接构成的非还原性二糖，在自然界广泛分布于多种环境生物体内，恰似天然的 “细胞保护剂”。诸多过往研究揭示，海藻糖具备非凡的生物保护特性，在高温、冷冻、干燥、高渗透压等严苛胁迫环境下，能够借助与生物大分子（如蛋白质、脂质、核酸）特异性相互作用，稳固其天然构象、维持分子间正常相互作用，进而有效保护细胞结构与功能完整性。鉴于此更好优势，本研究创新性地将海藻糖引入枯草芽孢杆菌电转化流程，深度探究其在优化电转化效率层面的可行性与作用机制，期望构建一套切实可行、高效稳健的枯草芽孢杆菌电转化优化方案，为相关科研与产业应用注入崭新活力。
菌株与质粒：枯草芽孢杆菌野生型菌株（实验室保藏，具备良好遗传稳定性与生长特性）；携带绿色荧光蛋白基因（GFP）的外源质粒（用于转化效率直观评估，其表达产物易于荧光检测与量化分析）。
主要试剂：海藻糖（分析纯，购自生物试剂公司，纯度≥99%）；电转化缓冲液（依据枯草芽孢杆菌特性自研调配，含适量甘露醇、HEPES 等成分以维持渗透压与 pH 稳定）；溶菌酶（用于细胞壁预处理，酶活单位达标，保障处理效果均匀一致）；DNA 提取与纯化试剂盒（高效提取高纯度、完整无缺的外源质粒 DNA）；常规生化试剂（如氯化钠、磷酸二氢钾等用于培养基配制）。
仪器设备：电转化仪（精准调控电脉冲参数，输出电压、电容、电阻等参数误差极小）；高速冷冻离心机（具备强大离心力与温控精度，满足细胞分离、洗涤步骤要求）；荧光显微镜（高分辨率成像，灵敏捕捉 GFP 荧光信号，准确量化转化子数目）；分光光度计（精准测定细胞浓度、DNA 浓度，确保实验体系用量精准把控）；恒温摇床（精准模拟微生物生长环境，温度、转速调控精准，保障菌株稳定培养）。
枯草芽孢杆菌的培养与预处理：挑取枯草芽孢杆菌单菌落接种至 LB 液体培养基（含胰蛋白胨 10 g/L、酵母提取物 5 g/L、氯化钠 10 g/L，pH 调至 7.0 - 7.2），置于 37℃、200 rpm 恒温摇床过夜培养至对数生长期（OD₆₀₀约为 0.6 - 0.8）。随后，冰浴冷却 15 - 20 分钟使细胞生长停滞，4℃、5000 rpm 离心 10 分钟收集菌体，用预冷的电转化缓冲液洗涤 2 - 3 次以去除残留培养基成分，并重悬于适量电转化缓冲液。在此基础上，设置多组实验组，分别添加不同终浓度（0、50 mM、100 mM、150 mM、200 mM）的海藻糖，同时设立对照组（不含海藻糖），37℃温和振荡孵育 30 - 60 分钟，部分实验组添加适量溶菌酶（终浓度约 0.5 - 1.0 mg/mL）协同预处理细胞壁，增强细胞通透性，处理完毕再次冰浴、离心、洗涤后备用。
外源质粒 DNA 的准备：运用商业化 DNA 提取与纯化试剂盒，依照操作手册从大肠杆菌宿主菌中提取携带 GFP 基因的质粒 DNA，经分光光度计精确定量浓度后，稀释至统一工作浓度（约 50 - 100 ng/μL），确保各转化反应体系中外源 DNA 量恒定且质量可靠。
电转化操作：将预处理后的枯草芽孢杆菌细胞悬液与等体积的外源质粒 DNA 轻柔混匀，转移至预冷的电转化杯中（电极间距恒定为 2 mm），置于电转化仪中，设置多组不同电脉冲参数组合（电压范围 500 - 2500 V，电容 5 - 25 μF，电阻 200 - 1000 Ω）进行电击转化，每组参数设置 3 - 5 个平行样以保障数据重复性与可靠性。电击完成后，迅速添加预冷的 LB 液体培养基（1 mL），37℃、100 rpm 低速复苏培养 1 - 2 小时，助力细胞修复受损结构、恢复正常生理代谢并表达外源基因。
转化子筛选与计数：复苏培养后的菌液适度稀释后，均匀涂布于含相应抗生素（依据外源质粒抗性标记选择，如氨苄青霉素、卡那霉素等）的 LB 固体培养基平板上，37℃倒置培养 12 - 16 小时，待菌落长出后，借助荧光显微镜在蓝光激发下观测 GFP 荧光表达情况，筛选阳性转化子（呈现明亮绿色荧光菌落），并人工计数各平板上转化子数目，结合稀释倍数换算出每微克外源 DNA 对应的转化子形成单位（CFU/μg DNA），以此作为衡量电转化效率的关键指标进行数据统计与分析。
经系统实验与数据统计，不同海藻糖浓度下枯草芽孢杆菌电转化效率呈现显著差异（图 1）。在未添加海藻糖的对照组中，电转化效率处于相对较低水平，仅约（1.2 ± 0.3）× 10² CFU/μg DNA。伴随海藻糖浓度逐步递增，转化效率呈现先上升后略有下降的趋势，当海藻糖终浓度达 100 mM 时，转化效率攀升至峰值，约为（5.6 ± 0.8）× 10² CFU/μg DNA，相较于对照组提升近 4.7 倍。这充分彰显适宜浓度海藻糖对电转化进程的积极促进作用，推测是因其有效维护了细胞在电击前后的结构完整性，减少 DNA 进入阻碍；而过高浓度下，可能因溶液渗透压过高对细胞产生额外胁迫，抵消部分保护优势，致使转化效率有所回落。
固定海藻糖最佳浓度（100 mM），深入探究不同预处理时长（0、15、30、45、60 分钟）对电转化效率的影响规律（图 2）。结果清晰表明，预处理时长在 0 - 30 分钟区间内，转化效率随时间延长稳步上扬，30 分钟时达效果，约（6.2 ± 0.7）× 10² CFU/μg DNA；超出此时长，效率渐趋平稳乃至微降。这意味着适当时长预处理为海藻糖与细胞充分作用、施展保护效能提供充裕时机，然过度延长并无额外显著增益，契合细胞生理响应动力学特征，为后续标准化操作流程确定精准时间参数。
进一步考察海藻糖与溶菌酶联合预处理方案效果（表 1）。单独使用溶菌酶预处理时，电转化效率较对照组有一定提升，达（2.1 ± 0.4）× 10² CFU/μg DNA；单独添加海藻糖（100 mM，30 分钟）对应效率为（5.6 ± 0.8）× 10² CFU/μg DNA；而二者协同作用下，转化效率飙升至（8.5 ± 1.2）× 10² CFU/μg DNA，显著优于各自单独处理效果。此现象归因于溶菌酶适度削弱细胞壁屏障，协同海藻糖强化细胞膜稳定性，双管齐下为外源 DNA 顺畅进入细胞内部开辟更优路径，实现转化效率的叠加式增长。
| 预处理方式 | 电转化效率（CFU/μg DNA） |
|---|
| 对照组（无预处理） | （1.2 ± 0.3）× 10² |
| 溶菌酶单独处理 | （2.1 ± 0.4）× 10² |
| 海藻糖（100 mM，30 分钟）单独处理 | （5.6 ± 0.8）× 10² |
| 海藻糖（100 mM，30 分钟） + 溶菌酶协同处理 | （8.5 ± 1.2）× 10² |
在海藻糖及其协同预处理确定最佳条件基础上，精细优化电脉冲参数。经多轮摸索，当电压设定为 1500 V、电容 15 μF、电阻 600 Ω 时，结合海藻糖（100 mM，30 分钟）与溶菌酶协同预处理，枯草芽孢杆菌电转化效率一举突破至（1.2 ± 0.2）× 10³ CFU/μg DNA，相较于初始未优化状态实现近 10 倍跃升，成功构建一套高效电转化体系，为后续基因工程操作筑牢根基。
本研究开创性地将海藻糖融入枯草芽孢杆菌电转化流程，通过全方面、深层次探究其在浓度、预处理时长、协同因素及整体转化流程各环节作用机制，实现电转化效率质的飞跃。从细胞微观层面解析，海藻糖凭借自身更好理化性质，于电击瞬间紧密结合细胞膜磷脂双分子层，加固膜结构、缓和电场诱导的膜穿孔损伤，降低膜修复能耗；于分子尺度，它环绕 DNA 分子，抵御自由基、离子冲击，保障外源 DNA 完整，提升摄入整合几率。与溶菌酶协同中，二者靶向细胞壁与膜，分工协作突破天然屏障。
在电转化参数优化维度，海藻糖的存在拓宽了参数适配范围，以往因损伤顾虑而受限的高电压、高电容设置，如今在其护航下得以启用，进一步增强电穿孔效果与转化效能。此优化体系不仅为枯草芽孢杆菌在异源蛋白高效表达、新型代谢途径构建等基因工程实践提供强劲技术支撑，其蕴含的基于小分子糖类保护剂提升微生物电转化效率思路，对大肠杆菌、乳酸菌等其他微生物电转化优化亦具借鉴价值，有望拓展至更广泛微生物领域，助力现代生物技术多场景应用革新。
综合而言，本研究成功构建以海藻糖为核心优化因子的枯草芽孢杆菌高效电转化体系，明确 100 mM 海藻糖经 30 分钟预处理，协同溶菌酶及精细电脉冲参数（1500 V、15 μF、600 Ω）配置，能使电转化效率从传统方法的低水平实现近 10 倍攀升。这一成果攻克了枯草芽孢杆菌电转化效率瓶颈难题，强化其作为基因工程优良宿主菌株优势，为相关产业（如生物制药、绿色化工）与科研创新注入澎湃动力，后续可围绕海藻糖与细胞深层次互作机制开展持续探究，进一步挖掘潜能、拓展应用边界。
