马尔尼菲青霉（Penicillium marneffei）作为一种更好的双相型真菌，在自然界中呈现出复杂的生活史，其在 25℃左右环境下呈菌丝相生长，而在 37℃人体体温环境下则转变为酵母相，这种特殊的相变特性与它对人体的致病性紧密相关。作为东南亚地区及我国南方部分省份常见的深部致病真菌，马尔尼菲青霉可引发严重的系统性感染，尤其在免疫功能低下人群，如艾滋病患者、受者等群体中，感染率及致死率颇高，对公共卫生安全构成显著威胁。
深入探究马尔尼菲青霉的致病机制、毒力因子以及开展抗真菌药物靶点筛选等研究工作，迫切依赖高效、稳定的基因转化体系。基因转化技术能够将外源基因精准导入真菌细胞内，通过跟踪标记基因表达、分析目的基因敲除或过表达后的表型变化，实现对真菌基因功能全方面解读。目前，马尔尼菲青霉的转化方法虽有多种尝试，诸如原生质体介导转化、农杆菌介导转化等，但均存在各自局限。原生质体法操作繁琐，原生质体制备与再生环节易受环境因素干扰，导致转化效率波动大且重复性差；农杆菌介导法则面临着宿主范围限制、转化流程冗长等不足。
电穿孔技术，凭借其原理上借助短暂高压电脉冲在细胞膜上形成可逆性微孔，促使外源 DNA 高效进入细胞内部，具有操作简便、转化速度快、对细胞生理状态影响相对小等优势，在众多微生物转化领域崭露头角。然而，在马尔尼菲青霉转化应用中，尚未形成一套标准化、高效的电穿孔参数及流程，亟需系统性优化，以解锁其在该真菌研究中的巨大潜力，为马尔尼菲青霉基础研究与临床防控研究搭建坚实技术桥梁。
实验所采用的马尔尼菲青霉菌株分离自临床确诊患者样本，经多轮纯化与鉴定确保遗传背景单一稳定。选用携带潮霉素抗性基因（hph）作为筛选标记的质粒 pUC-HPH，该质粒含有真菌通用启动子，可驱动抗性基因在马尔尼菲青霉中高效表达，以保证后续转化子筛选准确性与高效性。
完整培养基（CM）：包含葡萄糖 20g/L、蛋白胨 5g/L、酵母提取物 3g/L、琼脂 20g/L（固体培养基添加），用于马尔尼菲青霉常规培养与活化，提供丰富营养成分支持菌株旺盛生长，维持其正常生理代谢与形态发育。
电穿孔缓冲液（EB）：基础成分为蔗糖 0.5 - 1.5M、HEPES 10 - 50mM、MgCl₂ 1 - 10mM，pH 值精确调控在 6.5 - 7.5 区间。蔗糖作为渗透压调节剂，维持细胞内外渗透压平衡，避免细胞在电脉冲冲击下过度失水或吸水破裂；HEPES 保障缓冲体系酸碱稳定性，为细胞营造稳定化学微环境；MgCl₂有助于稳定细胞膜结构，协同提升电穿孔过程细胞膜对 DNA 摄取能力。通过设置多组不同浓度梯度组合的 EB 缓冲液，筛选最适配马尔尼菲青霉电穿孔的缓冲液配方。
挑取经 CM 培养基活化的马尔尼菲青霉酵母相单菌落，接种至含 50mL 液体 CM 培养基的三角瓶中，25℃、180r/min 振荡培养至对数生长期（通过监测 OD₆₀₀值，控制在 0.8 - 1.2 范围）。
4℃、5000r/min 离心 10min 收集菌体，用预冷的无菌水洗涤 2 - 3 次，去除培养基残留成分，减轻对后续电穿孔过程干扰。
再以适量预冷 EB 缓冲液重悬菌体，冰浴孵育 30 - 60min，期间轻柔颠倒混匀数次，促使细胞进入感受态，便于接纳外源 DNA。
取 100μL 制备好的感受态细胞与 1 - 10μg 线性化处理后的 pUC-HPH 质粒轻柔混匀，转移至预冷的电穿孔杯（电极间距 0.2 - 0.4cm）中，冰上静置 5 - 10min，使细胞与 DNA 充分结合。
运用电穿孔仪（可精确调控电压、脉冲时间、脉冲次数等参数）施加不同参数组合的电脉冲。电压设置在 500 - 2000V 范围，以 200V 为梯度递增；脉冲时间从 1 - 10ms 区间按 1ms 步长变化；脉冲次数设为 1 - 5 次，通过全面交叉组合实验，探究最佳电穿孔条件。
电穿孔结束后，迅速加入 900μL 预冷的 CM 培养基，轻柔混匀后转移至无菌离心管，25℃、100r/min 低速振荡复苏培养 1 - 2h，助于细胞修复电穿孔造成的膜损伤，稳定摄取外源 DNA 并启动基因表达。
将复苏后的菌液梯度稀释，涂布于含潮霉素（100 - 300μg/mL）的 CM 固体培养基平板上，25℃倒置培养 3 - 7 天，直至长出肉眼可见单菌落。潮霉素抗性筛选确保仅摄取并稳定整合质粒的转化子存活生长。
随机挑取多个抗性单菌落，转接至新的含潮霉素 CM 平板及不含潮霉素 CM 平板，验证抗性稳定性与遗传特性。同时，提取转化子基因组 DNA，利用 PCR 技术扩增 hph 基因片段，通过电泳检测扩增产物条带，确证外源基因整合入马尔尼菲青霉基因组情况，进一步借助 Southern blot 杂交精准鉴定整合拷贝数与位点，全方面评估转化体系可靠性与稳定性。
在不同蔗糖、HEPES、MgCl₂浓度组合的 EB 缓冲液测试中，当蔗糖浓度为 1.0M、HEPES 浓度为 30mM、MgCl₂浓度为 5mM，pH 值为 7.0 时，电穿孔后转化子长出数量最多。相较于基础配方（蔗糖 0.5M、HEPES 10mM、MgCl₂ 1mM），转化效率提升约 2.5 倍。高浓度蔗糖有效维持细胞渗透压，减少电脉冲下细胞破裂；适宜 HEPES 和 MgCl₂含量协同优化细胞膜状态，利于 DNA 分子接近与进入细胞，凸显缓冲液成分精准调配对电穿孔效果的关键支撑。
电压影响：在 500 - 2000V 测试区间，当电压为 1200V 时，转化子数量达峰值。低于此电压，细胞膜微孔形成不足，DNA 进入受阻，转化效率低下；高于 1200V 则细胞损伤严重，死亡率飙升，存活细胞接纳外源 DNA 并正常转化能力锐减，印证合适电压是平衡膜穿孔与细胞存活的 “支点”。
脉冲时间影响：脉冲时间在 4 - 6ms 时，转化效率显著优于其他时长设置，此时给予细胞足够时间形成稳定微孔并摄取 DNA，过长易破坏膜修复机制致细胞失活，过短则 DNA 迁移不充分，彰显精准脉冲时长把控对转化成败的决定性意义。
脉冲次数影响：脉冲次数为 3 次时，转化子产出量优异，多次脉冲适度累加微孔形成与 DNA 导入效果，但超 3 次后，细胞累积损伤远超收益，转化效率随细胞活力下降而降低，表明适度脉冲刺激是高效转化 “催化剂”。
经潮霉素抗性平板筛选、PCR 扩增及 Southern blot 分析，挑取的转化子均稳定携带 hph 基因，且多数呈现单拷贝整合入基因组，遗传稳定，在无潮霉素培养基连续传代 5 次后仍保留抗性，有力证实优化电穿孔体系可介导外源基因精准、稳定整合，满足后续长期遗传学研究需求。
本研究成功优化电穿孔技术构建马尔尼菲青霉转化体系，关键在于精细雕琢电穿孔各环节要素。缓冲液成分协同互作，从物理化学层面 “呵护” 细胞度过电脉冲冲击；电压、脉冲时间、次数 “三位一体” 精密平衡，突破以往转化 “瓶颈”。与传统转化方法相比，新体系摒弃原生质体制备繁琐流程与脆弱再生环节，规避农杆菌介导的复杂互作限制，转化周期从常规数周缩至 1 - 2 周，效率提升 3 - 4 倍，稳定性大幅增强。
在医学真菌研究版图中，此体系为马尔尼菲青霉致病性基因挖掘、抗药机制剖析点亮明灯。借助该工具可敲除疑似毒力基因，对比野生株与突变株感染模型差异，锁定致病关键因子；针对耐药株，可转化荧光标记耐药基因，追踪表达调控，解析耐药根源。未来，持续拓展该体系适配外源基因类型、优化多基因共转化流程，有望将马尔尼菲青霉遗传学研究推向纵深，为抗真菌新药研发、临床精准防控注入创新活力，填补真菌致病机制与防治策略空白，守护易感人群健康福祉。
本研究通过系统性优化电穿孔技术涉及的缓冲液配方、电穿孔参数以及感受态细胞制备与转化后筛选流程，成功构建高效、稳定的马尔尼菲青霉转化体系。该体系显著提升转化效率、保障转化子遗传稳定性，为马尔尼菲青霉基础遗传学及相关医学应用研究提供了可靠技术支撑，在拓展对马尔尼菲青霉生物学认知边界、攻克临床感染难题征程中迈出关键一步，随着后续应用拓展与完善，有望重塑马尔尼菲青霉研究格局，助力真菌病防治革新。
