文章原创 阿YiYi 文章来源：科研综述
基因治疗是一种用于治疗或预防疾病的医学技术，通过将健康的基因导入患者体内来替代或修复有缺陷的基因。这种方法旨在纠正导致疾病的基因突变或功能异常，从而恢复或改善患者的正常生理功能。
基因治疗的主要原理是通过引入、修复、或编辑患者体内的基因，以纠正或补偿导致疾病的遗传缺陷或基因异常。
图1. 基因治疗原理示意图 [1]
具体来说，基因治疗的核心原理包括：
基因替代
用健康的基因替代缺陷基因，使细胞能够产生正常功能的蛋白质。例如，将健康的基因导入细胞中，以替代突变的或缺失的基因。
基因修复
通过基因编辑技术直接修复体内的突变基因，恢复其正常功能。常用的基因编辑工具包括CRISPR-Cas9、ZFNs和TALENs。
基因沉默
使用RNA干扰（RNAi）或反义寡核苷酸（ASO）技术抑制有害基因的表达，防止其产生病理性蛋白质。
基因补充
为患者提供缺乏的基因产物（如特定酶或蛋白质），以补偿体内的生理缺陷。
图2. 用于人类基因治疗的三种基本工具 [2]。腺相关病毒（AAV）和慢病毒载体是最近获得批准的多种基因疗法的基础。基因编辑技术目前还处于转化研究和临床应用的初期阶段，但预计将在该领域发挥越来越重要的作用。
一、病毒载体
腺病毒载体（Adenoviral Vectors）：腺病毒可以感染多种细胞类型并高效传递基因，能够携带较大的基因片段进入宿主细胞。由于不整合入宿主基因组，降低了插入突变的风险。然而，由于腺病毒载体可能引发强烈的免疫反应，因此通常用于短期基因表达。
图3. 腺病毒的结构和基因组组织 [3]
腺相关病毒载体（Adeno-Associated Viral Vectors, AAV）：AAV是一种不引起疾病的小型病毒，免疫原性低，能够携带较小的基因片段并将其导入细胞。AAV载体可长期存在于细胞中，并在一定程度上稳定表达目标基因，因此适用于长期基因表达和慢性疾病的治疗。
图4. AAV载体转导途径 [4]。腺相关病毒（AAV）载体颗粒首先与靶细胞表面的受体和共受体结合（步骤1），并通过内吞作用进入这些细胞的内涵体（步骤2）。从内涵体释放后，AAV颗粒要么被泛素化并针对蛋白酶体介导的降解（步骤3），要么在细胞内被转运至细胞核（步骤4）。一旦进入细胞核，AAV颗粒的衣壳被去除，AAV基因组被释放（步骤5）。然后，AAV的单链DNA基因组被转化为双链DNA（步骤6），接着是转录（步骤7）和mRNA的核输出（步骤8），以便进行翻译和治疗性转基因的表达（步骤9）。通过工程化改造AAV载体影响其转导途径的任何步骤都会影响其转导效率。 ER：内质网；ssAAV：单链AAV；Ub：泛素。
3. 慢病毒载体（Lentiviral Vectors）：慢病毒载体是一种来源于HIV-1的病毒载体，能够将基因整合到宿主细胞的基因组中，实现稳定且长期的基因表达。
图5.第三代慢病毒载体[5]。第三代慢病毒载体由两个独立的包装质粒组成，一个编码gag和pol，另一个编码rev。此外，还有一个质粒编码来自VSV-G（水疱性口炎病毒）的包膜蛋白。编码目标基因的质粒包含经过改造的慢病毒LTR（长末端重复）序列，这些序列被改造成自灭活（SIN）型，以防止重组。LTR指长末端重复，VSV指水疱性口炎病毒。这种载体不仅能够感染分裂中的细胞，还可以感染非分裂细胞，因此在基因治疗中具有广泛的应用。慢病毒载体特别适用于治疗血液系统疾病和遗传性疾病，如β-地中海贫血和X-连锁重症联合免疫缺陷症（SCID）。
图6.慢病毒载体的主要临床用途 [5]。a.原发性免疫缺陷的矫正。使用病毒载体传递共同γ链（γc），可以恢复SCID-X1患者的免疫功能。b. 肿瘤特异性T细胞受体（TCR）的传递。慢病毒载体可用于在体外将识别黑色素瘤抗原的MART-1 TCR引入患者的T细胞中。经过修饰的T细胞现在能够识别黑色素瘤细胞，并作为癌症治疗手段被输注回患者体内。 c. 嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法。使用慢病毒载体可以将由三个不同结构域（抗原识别、共刺激信号传导、T细胞信号传导）构成的CAR引入T细胞中。表达修饰受体的细胞能够识别目标抗原，并利用T细胞强大的细胞毒活性攻击肿瘤细胞。目前，大多数临床试验中的CAR T细胞疗法靶向CD19抗原，这是一种在B细胞和B细胞恶性肿瘤中表达的蛋白质。 SCID：重症联合免疫缺陷症。
4. 逆转录病毒载体（Retroviral Vectors）：逆转录病毒载体可以将基因插入宿主细胞的基因组中，实现长期表达，主要在分裂中的细胞中起作用。尽管这种载体常用于血液系统疾病的治疗，但其可能导致插入突变，从而引发其他健康问题。
图7. 逆转录病毒靶向策略 [6]。逆转录病毒载体可以通过以下方式进行改造：插入配体或抗体片段（工程化糖蛋白）、使用来自其他逆转录病毒的糖蛋白（伪型化），或使用双特异性抗体（非遗传靶向）。
二、非病毒载体
1. 质粒（Plasmid DNA）：质粒DNA通过电穿孔或脂质体转染等物理或化学方法导入细胞。这些方法在体外实验中广泛应用，因其较低的免疫原性和无病毒成分的特性，适合初步研究。然而，质粒DNA通常不能整合到宿主基因组中，因此基因表达往往是暂时的。对于某些长期基因表达的应用，质粒的短暂表达可能是一个限制因素。
图8.三重转染策略用于AAV生产[7]。这种方法通过引入关键基因至一个DNA质粒（左上方），以及两个其他质粒（左下方），消除了对“辅助”腺病毒的需求。这三个质粒被转染到生产细胞系中（中间），该细胞系会产生包含目标转基因的成熟AAV衣壳。经过纯化（右侧）后，这些病毒颗粒可以感染患者细胞并传递其DNA载荷，但无法进一步复制。
2. 脂质体（Liposomes）：脂质体是一种由脂质双层包裹DNA或RNA的非病毒载体。通过与细胞膜融合，脂质体能够将包裹的基因物质导入细胞。脂质体的优势在于其低免疫原性和生物相容性，但其基因转染效率较低，特别是在体内应用时。这种方法通常用于将小核酸（如siRNA）导入细胞，且更适合短期基因表达或局部治疗。
图9. 针对基因治疗使用的不同类型脂质体的研究分布情况[8]
3. 聚合物纳米颗粒（Polymer Nanoparticles）：聚合物纳米颗粒通过化学聚合物材料包裹基因物质，形成能够通过细胞内吞进入细胞的纳米颗粒。这种技术允许对聚合物材料的物理化学性质进行调整，以优化基因转移效率并降低免疫反应。尽管聚合物纳米颗粒展示了良好的潜力，特别是在定向治疗和药物释放方面，但其基因传递效率在体内应用中仍需要进一步改进。
图10. 用于DNA和siRNA细胞内递送的聚合物纳米颗粒[9]。(1) 阴离子DNA和siRNA与阳离子聚合物复合形成聚合物复合体； (2) 通过不同的内吞途径将聚合物复合体摄入细胞； (3) 聚合物复合体在内体-溶酶体隔室中包裹并随后释放； (4) 聚合物复合体释放自由的DNA和siRNA，留下聚合物残余；(5) DNA通过核膜转运蛋白转移至细胞核进行表达，siRNA与RNA诱导的沉默复合体（RISC）结合。
三、基因编辑工具
CRISPR-Cas9：CRISPR是一种强大的基因编辑工具，可以精确地切割并修复特定基因，从而纠正基因突变或删除有害基因。CRISPR技术应用广泛，已被用于多种疾病的基因治疗研究。
图11. 基因组编辑平台及内源DNA双链断裂（DSB）修复机制[10] 。基因组编辑核酸酶（如ZFN、TALENs和CRISPR/Cas9）在靶向位点诱导双链断裂（DSB）。双链断裂可以通过非同源末端连接（NHEJ）修复，或在存在供体模板的情况下通过同源重组（HDR）修复。通过NHEJ靶向位点进行基因破坏会导致插入/缺失突变（indels）的形成。当两个双链断裂靶向致病扩增或插入的两侧时，可以创建对中间序列的治疗性缺失，从而实现NHEJ基因修正。在存在供体修正的HDR模板的情况下，HDR基因修正或基因添加会在期望的位点诱导双链断裂。缩写：DSB，双链断裂；ZFN，锌指核酸酶；TALEN，转录激活因子样效应核酸酶；CRISPR/Cas9，簇集规律间隔短回文重复相关9核酸酶；NHEJ，非同源末端连接；HDR，同源重组修复。
TALENs（转录激活样效应因子核酸酶）：通过识别特定的DNA序列进行定点切割，实现基因编辑。
3. 锌指核酸酶（ZFNs）：使用锌指蛋白结合特定DNA序列进行基因编辑。
四、RNA干扰（RNAi）和小RNA（siRNA）
用于基因沉默，通过引入特定的siRNA或shRNA抑制特定基因的表达，达到治疗效果。
图12. miRNA（a）和siRNA（b）的工作机制示意图 [11]
五、基因剪接技术
例如 Spliceosome-mediated RNA trans-splicing (SMaRT)，通过改变mRNA剪接，修复或替换有缺陷的基因序列。
图13. 三种SMaRT方法的示意图 [12]。5'转接剪接、3'转接剪接和内部剪接修复（IER），分别靶向突变目标前体mRNA的5'端、3'端或内部部分。
基因治疗的应用领域非常广泛，涵盖了多种遗传性疾病、癌症、罕见病以及某些感染性疾病。
一、遗传性疾病
基因治疗在单基因遗传病中取得了显著进展，例如：
脊髓性肌（SMA）：通过将SMN1基因的功能性副本导入患者体内，可以显著改善患者的运动功能和生存率。Zolgensma是针对SMA的基因治疗药物，已被批准用于临床。
图14. 脊髓性肌（SMA）基因治疗的简化示意图[13]
血友病：通过基因治疗将功能性凝血因子基因导入患者体内，可以减少或消除患者的出血症状。Spark Therapeutics开发的基因疗法已经在临床试验中展示了良好的疗效。
图14.AAV基因治疗血友病的历史回顾 [2]
镰刀型细胞贫血症和地中海贫血：通过将正常的β-珠蛋白基因引入患者的造血干细胞，能够纠正血红蛋白的生成缺陷，减轻或消除疾病症状。
图15：镰状细胞病基因治疗的步骤。
二、癌症
嵌合抗原受体T细胞疗法（CAR-T）：通过基因工程手段改造患者的T细胞，使其能够识别并杀死癌细胞。CAR-T细胞疗法在治疗B细胞白血病和淋巴瘤中表现出显著的疗效，并已获得FDA批准。
图16. 癌症患者中CAR T细胞的生成和施用[14]。(A) T细胞通过血液单采从患者的血液中收集。随后，它们被基因工程改造以表达CAR，并在体外进行培养扩增。然后将CAR T细胞输注回患者体内，这些细胞识别其靶标并杀死表达该靶标的肿瘤细胞。 (B) 四代CAR T细胞基本结构的示意图。
图17. CAR-T细胞疗法的历史概述 [2]
肿瘤抑制基因恢复：基因治疗还可以通过恢复或增强肿瘤抑制基因（如p53）的功能，抑制肿瘤的生长和扩散。
三、罕见病
视网膜疾病：基因治疗在治疗某些遗传性视网膜疾病（如Leber先天性黑矇症）方面取得了成功。Luxturna是一种用于治疗RPE65基因突变引起的遗传性视网膜疾病的基因治疗药物，已被批准用于临床。
图18. 基于RPE65基因治疗的临床前里程碑[15]
代谢性疾病：例如肝豆状核变性，通过基因治疗将缺陷的ATP7B基因功能恢复，可以纠正体内铜代谢异常，预防严重的肝脏和神经系统损伤。
四、心血管疾病
家族性高胆固醇血症（FH）：通过基因治疗纠正低密度脂蛋白受体（LDLR）的基因突变，可以降低患者的胆固醇水平，减少心血管疾病的风险。
图19. 针对家族性高胆固醇血症（FH）患者的新兴基因治疗方法 [16]。小干扰RNA（siRNA）和反义寡核苷酸（ASO）可以通过基因沉默抑制PCSK9和其他不利于降脂的靶点；CRISPR-Cas9、基因编辑和巨核酸酶可以修复功能失调的LDLR或通过基因编辑生成LDLR，从而使不利于降脂的靶点失活；腺病毒、外泌体和基于纸纳米抗体的递送工具可以将上述物质递送至肝细胞。
五、感染性疾病
HIV：基因治疗正在探索通过基因编辑或基因转移手段，抵御HIV感染。例如，通过CCR5基因敲除技术，赋予T细胞对HIV的抗性，阻止病毒入侵。
图20. 传统的HIV基因治疗.(A) 体外基因递送[17]。使用合适的载体在体外对自体CD4+ T细胞或CD34+造血干祖细胞（HSPCs）进行基因修饰。修饰后的基因细胞被输注回患者体内。 (B) 基因修饰HIV靶细胞的阳性选择。HIV在易感的HIV靶细胞（红色）中复制。基因修饰的细胞（绿色）对感染具有抵抗力，并累积到具有治疗意义的水平。 (C) HIV复制周期和基因治疗示例。RT，HIV逆转录酶；IN，HIV整合酶。
六、神经系统疾病
帕金森病：基因治疗在帕金森病中的应用研究包括通过将编码多巴胺合成酶的基因引入基底神经节，以补充多巴胺缺乏，从而减轻帕金森病的症状。
图21. 基因治疗在神经退行性疾病中的递送途径 [18]。尽管通过静脉注射或脑脊液（鞘内、脑室内和脑膜下路径）给药可以有效治疗多灶性疾病，但实质内注射是脑部疾病常用的递送途径。对于眼部疾病来说，局部基因递送更为优选，因为其手术和器械操作相对简单。肌内注射提供了一种疫苗和抗体递送及生产的策略，而子宫内注射可能为治疗遗传性神经退行性疾病提供一种方法。
亨廷顿病：研究人员正在探索通过基因沉默技术（如RNA干扰）抑制导致亨廷顿病的突变基因表达，从而延缓或阻止疾病进展。
七、免疫缺陷疾病
重症联合免疫缺陷症（SCID）：通过将正常的IL2RG基因或ADA基因引入患者的造血干细胞中，基因治疗能够恢复患者的免疫功能。这一技术已经在多例SCID患者中取得成功，显著提高了患者的生存率。
图22. IL2RG基因位点的基因组靶向,基因组整合和修正结果的示意图[19]
基因治疗的应用正在快速扩展，并随着技术的进步和临床经验的积累，越来越多的疾病将能够通过基因治疗得到有效的治疗。尽管基因治疗仍面临许多挑战，如治疗的长期效果、安全性、成本和伦理问题，但其在临床上的成功应用已经显现出巨大的潜力。
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