八聚体锥形孔跨膜蛋白——MspA蛋白
耻垢分枝杆菌毒素蛋白（Mycobacterium smegmatisporin A, MspA）是一种通道形成蛋白，用于小分子和水的通道。MspA是分子量 20 kDa 的单体蛋白构建的同源性八聚体，其形状为“八”字形杯状结构。MspA长度大约 1 nm，具有大约1 nm的宽度收缩区，两侧有明显较大的直径区域。
MspA 拥有很好的化学稳定性和热稳定性，在 100℃的温度下活性能耐受 30 min，在80℃的2% SDS条件中培养15分钟依然可以保持良好的通道活性，在 pH 0~14 的范围内保持稳定，同时MspA具有易于进行多位点突变修饰。
图1 MspA突变体的结构与表达
MspA是一种纳米孔分析的理想材料
MspA 的几何形状可以提供很好的空间分辨率，因为离子电流阻塞的特征主要是由穿过孔隙狭窄区域的多核苷酸片段决定的。另外，MspA 拥有很好的化学稳定性和热稳定性，最后，MspA可以为多种氨基酸替代保留高水平表达和通道活性，是一种通过定点诱变进行工程设计的理想选择。近年来，MspA蛋白在单分子检测领域的研究和应用得到越来越多关注，MspA蛋白纳米孔最重要的应用集中在DNA测序方面，主要用于检测表征ssDNA。
图2 纳米孔测序原理
MspA在生物和医学展现应用潜力
MspA作为一种具有锥形结构的八聚体孔道蛋白，通过引入突变开发工程化MspA孔道，可以实现多种单糖直接区分，说明MspA是核酸与多种生物大分子检测的有力品。
MspA是细菌细胞外膜上亲水性营养溶质的主要通道，负电性密集的收缩区具有天冬氨酸的双圈结构，能够与阳离子结合。使用合适的通道阻断剂可以堵塞MspA蛋白孔，则亲水性营养溶质不能输送进细菌体内，造成细菌休眠，同时可以破坏细胞外壁的稳定性，增强细菌的抗生素易感性，对于疾病治疗具有重要作用。
图3 MspA实现单糖区分
珀罗汀基于无细胞体系成功表达MspA八聚体跨膜蛋白
客户案例
收到MspA序列后，珀罗汀构建融合了GFP的线性化表达模版，随后，采用自主研发的PLD无细胞蛋白表达试剂盒（膜蛋白（或困难蛋白）表达增强版，#PLDK002）进行蛋白合成，蛋白合成后采用9种方案进行合适的表面活性剂筛选，对于目的蛋白的表达结果采用SDS-PAGE进行鉴定。
图4 目的蛋白表达鉴定
（channel 1：空白对照；channel 2~10：不同方案的目的膜蛋白表达情况；channel 11：marker）
之后，选择PLDK002-C（channel 3）和PLDK002-I（channel 9） 的无细胞蛋白表达体系进行第二轮优化。优化结果显示，channel 5的无细胞蛋白表达方案可以正确表达该MspA的单体与多聚体。
图5 MspA目的蛋白表达鉴定
客户评价
这次选择比较新颖的无细胞蛋白表达体系进行MspA表达，珀罗汀仅用4天完成小试，相当快速，胶图结果中单体和多聚体的亚基都是对的。相比于细胞表达体系，无细胞体系可以轻松实现多亚基膜蛋白表达及正确组装的难题。对于复杂多亚基超结构膜蛋白的结构研究和物理、化学、生物性质研究而言，这无疑是巨大的福音。
珀罗汀推荐
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Tom Z, Mikhail P,et al.Single-molecule DNA detection with an engineered MspA protein nanopore. PNAS,doi 10.1073 (2008).
SY Zhang,ZY Cao,et al.A Nanopore-Based Saccharide Sensor. Angew.Chem. Int.Ed.doi.org/10.1002/anie.202203769 (2022).
Ayomi S. Perera,et al. Channel Blocking of MspA Revisited. Langmuir.doi.org/10.1021/la3037296 (2012).
