细胞凋亡检测全攻略

一、概述

细胞凋亡是一种细胞主动有序的死亡，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等作用，它并不是病理条件下自体损伤的一种现象，而是为了更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡。今天，小爱向大家介绍细胞凋亡六大常用方法：细胞膜磷脂酰丝氨酸检测、TUNEL缺口末端标记法、线粒体膜电位检测、Caspase凋亡核心分子检测、形态学观察、线粒体膜电位转换孔检测。

细胞凋亡检测方法大全

二、检测方法

1、细胞膜磷脂酰丝氨酸检测

基于细胞代谢物进行的检测方法有Annexin V-FITC/PI检测法(abs50001)、Annexin V-EGFP/PI检测法(abs50006)、Annexin V-APC/PI检测法(abs50009)、Annexin V-PE/7-AAD检测法(abs50007)、Annexin V-APC/7-AAD检测法(abs50008)。今天，小爱给大家着重讲一下Annexin V-FITC/PI检测法。

（1）检测原理

Annexin V/PI检测原理

（2）适用样本：贴壁细胞、悬浮细胞

（3）设备：流式细胞仪/荧光显微镜

（4）优势：Annexin是目前最敏感的指标之一；定性、定量

（5）Annexin V细胞凋亡检测结果

在荧光显微镜下，以Annexin V-FITC＆PI双染可以鉴别正常细胞、早期凋亡、晚期凋亡和坏死细胞。如上图所示，a、b、c为荧光显微镜下的凋亡细胞，其中a、b分别为Annexin V-FITC和PI单染，c为Annexin V-FITC＆PI双染；d为普通光学显微镜下的凋亡细胞（红色箭头所指为晚期凋亡细胞，绿色箭头所指为早期凋亡细胞）。

Annexin V 细胞凋亡流式检测结果

客户使用Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒(abs50001)的效果如上图，文献名称：Serine metabolism antagonizes antiviral innate immunity by preventing ATP6V0d2-mediated YAP lysosomal degradation 期刊：Cell Metabolism影响因子： 27.287

（6）Annexin V细胞凋亡检测注意事项

A、建议不用含EDTA的胰酶消化贴壁细胞；

B、建议在用胰蛋白酶处理前单独收集培养液中悬浮的细胞，保存在2%的BSA中；

C、试剂使用前低速离心，以免液体积存管盖和管壁；

D、Annexin V-FITC和PI是光敏物质，在操作时请注意避光。在处理和标记时，尽可能在暗处进行。在孵育阶段，用铝箔包裹容器或置于抽屉中。细胞标记后，在暗室内用显微镜观察；

E、整个操作过程动作要尽量轻柔，勿用力吹打细胞，尽量在4℃下操作，以免影响细胞状态；

F、在细胞洗涤的最后一步，请尽量将上清弃净，以免PBS残留，有可能会影响实验结果；

G、为防止荧光衰变，宜在1h内进行流式检测；

H、PI 染色时间过长有可能造成检测的凋亡率偏高，建议首先进行Annexin V-FITC染色，最短可在上机前5min再加入PI染色。

（7）Annexin V试剂盒选择指南

2、TUNEL缺口末端标记法

基于TUNEL缺口进行的检测方法有TUNEL-Biotin检测法(abs50022)、TUNEL-488检测法(abs50047)、TUNEL-594检测法(abs50058)。今天，小爱给大家着重讲一下TUNEL-488检测法。

（1）检测原理

TUNEL缺口末端标记法检测原理

基因组DNA双链或单链断裂时会出现产生大量的粘性3'-OH末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)的催化作用下，与488/Cy-dUTP结合，从而通过荧光显微镜或流式细胞仪直接进行凋亡细胞的检测。

（2）适用样本：贴壁细胞、悬浮细胞、细胞涂片、石蜡切片、冰冻切片

（3）设备：流式细胞仪、光学/共聚焦/荧光显微镜，荧光酶标仪等

（4）优势：操作简单，定性准确

（5）TUNEL细胞凋亡检测FAQ

A、红色荧光和绿色荧光的试剂盒与生物素标记的试剂盒有何不同？

最大的区别在于适配的仪器不同，生物素标记的试剂盒适配光学显微镜，所以在细胞核染色时生物素标记的试剂盒一般适配苏木素或者甲基绿，荧光素标记的试剂盒一般适配DAPI ，但是荧光素标记的试剂盒实验时间、短操作简便、结果易观察。

B、阳性对照和阴性对照的作用？

阳性组对照用来验证本次实验操作和试剂盒有无问题，阴性组对照为了排除细胞自身凋亡、操作过程、或者染料等原因导致的非特异性染色，也用于调整拍摄曝光强度。一般情况下只需一个阳性对照和一个阴性对照，多个组织也可以设立多个阴性对照。

C、非特异标记（假阳性）？

a、细胞或组织的核酸酶或聚合酶活性水平较高（如平滑肌），DNA被切断，易导致假阳性。建议：取出细胞或组织后要立即并充分固定，阻止这些酶的活性，设置阴性对照有助于判断；

b、内源性过氧化物酶影响，建议：对于肝脏、肾脏等血细胞含量多的组织，适当延长封闭时间和升高过氧化氢的浓度；

c、固定液浓度过高或过低，导致组织中心部分固定效果不佳，而使得中心部细胞自溶、DNA链出现不规则断裂，产生假阳性。建议：推荐使用4%多聚甲醛；

d、TdT酶反应时间过长或Tunel反应过程中反应液发生蒸发或渗漏，细胞或组织表面不能保持湿润。建议：注意控制反应时间，并确保TdT酶反应液能覆盖样品；

e、石蜡、脂肪、血液、体液等都较易与染料结合，所以组织切片制作时要保持干净、脱蜡要che底；

f、有些试剂或细胞存在自发荧光，选择染料时要避开自发荧光的颜色。

D、没有染上荧光？

a、固定不充分。固定液选4%多聚甲醛，现用现配。不建议使用乙醇，乙醇固定液对组织的渗透力较弱，影响TUNEL标记效率；

b、细胞膜和核膜的通透不充分，TdT酶未能到达核内。细胞与冰冻切片，可用2% Triton X-100溶液通透5-30min，石蜡切片推荐使用蛋白酶K，37℃通透30min；不同的细胞和组织所需要的通透时间略有不同，时间太长容易脱片，适当调整；

c、延长标记时间至2h，并适当增加TdT酶及dUTP的用量；

d、确定实验对象细胞有凋亡。准备一份DNase I处理的阳性对照，验证TdT酶反应是否正确进行。

E、荧光背景高？

a、支原体污染：可以使用支原体染色检测试剂盒验证；

b、TdT酶反应时间过长，可以用试剂盒提供的TdT酶稀释液将TdT酶稀释2-5倍后再按照说明书操作，稀释后的TdT酶仅供当日使用；

c、DAB孵育时间过长，减少DAB染色时间；

d、处于高速分裂和增殖状态中的细胞，有时也会出现细胞核中的DNA断裂。建议：在非高增殖期取样检测；

e、有些试剂或细胞存在自发荧光，选择染料时要避开自发荧光的颜色；

f、Biotin-X-dUTP的非特异性结合，在TdT酶反应之后，再用含0.1% Triton X-100和1mg/mL BSA的PBS洗三次。

F、标记率低？

a、乙醇、甲醇或甲醛（市面上购买的甲醛大多含有甲醇）固定的样品标记效率较低（因为在固定时染色质未能与蛋白质交联，而在操作中丢失），采用推荐的固定液；

b、固定时间过长，导致交联程度过高，减少固定时间；

c、贴壁细胞如果使用药物诱导凋亡，会细胞皱缩，贴壁黏附力降低，导致凋亡细胞容易脱落。建议：请注意操作轻缓，防止发生凋亡的细胞在洗涤时被洗去。后续整个操作也需要轻缓。

（6）TUNEL试剂盒选择指南

TUNEL细胞凋亡试剂盒（绿色荧光）(abs50047)

3、Caspase凋亡核心分子检测

基于Caspase凋亡核心分子进行的检测方法有Caspase 1活性检测法(abs50023)、Caspase 2活性检测法(abs50024)、Caspase 3/7活性检测法(abs50025)、Caspase 4活性检测法(abs50026)、Caspase 6活性检测法(abs50027)。今天，小爱给大家着重讲一下Caspase 3/7活性检测法。

（1）检测原理

Caspase-3活性检测试剂盒的检测原理图

基于Caspase 3/7可以催化底物Ac-DEVD-pNA产生黄色的pNA (p-nitroaniline)，从而可以通过测定吸光度来检测caspase 3/7的活性。pNA在405nm附近有强吸收。

（2）适用样本：贴壁细胞、悬浮细胞、组织样品

（3）设备：流式细胞仪、共聚焦/荧光显微镜，荧光酶标仪等

（4）优势：灵敏度高，特异性强，与其他已知Caspases无交叉反应

4、线粒体膜电位检测

基于线粒体膜电位进行的检测方法有线粒体膜电位检测试剂盒(JC-10)(abs50017)、线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)(abs50016)。

（1）检测原理

线粒体膜电位检测试剂盒(JC-10)检测原理图

线粒体跨膜电位(Δψm)的下降，是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件，利用染料追踪测试线粒体膜电位。

（2）适用样本：贴壁细胞、悬浮细胞、纯化线粒体

（3）设备：流式细胞仪、共聚焦/荧光显微镜，荧光酶标仪等

（4）JC-1细胞凋亡检测结果

Fluorescence images of JC-1-stained chondrocytes

Flow cytometry results of JC-1-stained chondrocytes

客户使用线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)(abs50016)的效果如上图，文献名称：Curcumin exerts chondroprotective effects against osteoarthritis by promoting AMPK/PINK1/Parkin-mediated mitophagy 期刊：Biomedicine & Pharmacotherapy  影响因子： 7.18

5、线粒体膜转换孔检测

基于线粒体膜转换孔进行的检测方法有线粒体通透性转换孔(MPTP)检测试剂盒(abs50064)。

（1）检测原理

线粒体通透性转换孔(MPTP)检测原理图

当细胞发生凋亡时和病理性死亡时，线粒体膜电位转换孔渗透性发生改变，Ca²⁺的过载，线粒体谷胱甘肽的氧化，活性氧水平的升高，包括后继细胞色素C的释放，线粒体膜电位下降等都会导致线粒体渗透性转换孔的激活。

（2）适用样本：贴壁细胞、悬浮细胞

（3）设备：流式细胞仪、共聚焦/荧光显微镜，荧光酶标仪等

（4）染料：Calcein AM

6、形态学观察

基于细胞形态学观察进行的检测方法有荧光显微镜/光学显微镜观察法{DAPI染色法(abs47047616)、Hoechest 染色法(abs47047620)、AO染色法(abs9735)、HE染色法(abs9217)}、透射电子显微镜观察法。

（1）荧光显微镜/光学显微镜观察法

A、检测原理

Emodin induces apoptosis of human cervical cancer hela cells via intrinsic mitochondrial and extrinsic death receptor pathway. Cancer cell international. 13. 71. 10.1186/1475-2867-13-71.

借助相应的染色方法，直接观察细胞形态的改变。常用荧光染料有Hoechest 33342、吖啶橙(AO)、DAPI等；化学染料有苏木精 -伊红(HE)、姬姆萨(Giemsa)或赖特(Wright)

B、样本类型：贴壁细胞、悬浮细胞、细胞涂片、石蜡切片、冰冻切片

C、优势：操作简单，成本低

D、缺点：主观性较大，定性和定量较差，极少单独使用

（2）荧光显微镜/光学显微镜观察法

A、检测原理

Hydrostatic pressure can induce apoptosis of the skin. Scientific Reports. 10. 10.1038/s41598-020-74695-5.

细胞凋亡发生时会出现一定的形态学特征，电镜下凋亡细胞表现为染色质凝集、核浓缩、核裂解、胞浆收缩和胞膜具有发泡现象及凋亡小体出现等。

B、样本类型：贴壁细胞、悬浮细胞、细胞涂片、石蜡切片、冰冻切片

C、优势：经典、可靠，金标准

D、缺点：成本高、耗时长，步骤繁琐，无法定量，判定时存在主观性，一次只能观察小片区域。

今天讲解就到这了，大家如有细胞培养问题，欢迎一起交流哦！

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