脂质体与电穿孔转染大鼠视网膜细胞比较

一、引言

二、材料与方法

（一）实验材料

1. 大鼠视网膜细胞来源：选取健康的成年 Sprague - Dawley 大鼠，在无菌条件下取出眼球，采用酶消化法分离获取视网膜细胞，并进行原代培养。培养所用的培养基为含有特定比例的胎牛血清、谷氨酰胺、青霉素 - 链霉素等营养成分的 DMEM/F12 培养基，培养环境为 37°C、5% CO₂ 的细胞培养箱。

2. 转染试剂与质粒

• 脂质体转染试剂选用市售的产品（如 威尼德 ），按照产品说明书进行保存和使用前的准备。

• 电穿孔转染仪采用专门用于细胞电穿孔操作的仪器（如 Bio - Rad Gene Pulser、威尼德），配备相应的电穿孔 cuvette。

• 用于转染的质粒为携带绿色荧光蛋白（GFP）基因的真核表达质粒，该质粒在构建过程中经过严格的基因克隆技术操作，确保其序列的准确性和完整性。在使用前，对质粒进行大量提取和纯化处理，测定其浓度和纯度，以保证转染实验的准确性。

（二）实验分组与转染操作

1. 实验分组

• 将培养至合适密度的大鼠视网膜细胞随机分为三组：脂质体转染组、电穿孔转染组和未转染对照组。每组设置多个重复样本，以确保实验结果的可靠性和统计学意义。

2. 脂质体转染操作

• 在转染前一天，将大鼠视网膜细胞接种于 24 孔板中，使细胞在转染时达到约 50% - 60% 的汇合度。

• 取适量的脂质体转染试剂与纯化后的质粒 DNA 分别在不同的管中用无血清培养基进行稀释，然后将两者轻轻混合，室温下孵育一定时间（通常为 20 - 30 分钟），以形成脂质体 - DNA 复合物。

• 将形成的复合物逐滴加入到细胞培养孔中，轻轻晃动培养板使复合物均匀分布，然后将细胞放回培养箱中继续培养。在转染后的不同时间点（如 24 小时、48 小时、72 小时）收集细胞进行后续检测。

3. 电穿孔转染操作

• 同样在转染前一天将大鼠视网膜细胞接种于合适的电穿孔 cuvette 中，使细胞密度达到预定要求。

• 将纯化后的质粒 DNA 加入到细胞悬液中，轻轻混匀，然后将 cuvette 放入电穿孔转染仪中。设置合适的电穿孔参数，包括电压（如 200 - 300 V）、脉冲时间（如 20 - 50 ms）、脉冲次数（如 1 - 3 次）等，根据预实验和相关文献报道进行优化选择。

• 启动电穿孔程序，在脉冲结束后，迅速将细胞转移至预先准备好的含有完整培养基的培养板中，放入培养箱中培养。在转染后的相同时间点（24 小时、48 小时、72 小时）收集细胞进行检测。

（三）检测指标与方法

1. 转染效率检测

• 荧光显微镜观察：在转染后的不同时间点，将细胞置于荧光显微镜下观察。由于转染的质粒携带 GFP 基因，成功转染的细胞会发出绿色荧光。通过随机选取多个视野，计数发出荧光的细胞数与总细胞数的比例，初步评估转染效率。同时，观察细胞的形态和荧光分布情况，以了解转染对细胞结构的影响。

• 流式细胞术定量分析：收集转染后的细胞，用 PBS 缓冲液洗涤细胞两次，然后重悬于适量的 PBS 中。将细胞悬液上流式细胞仪进行检测，通过设置合适的荧光检测通道，对 GFP 阳性细胞进行计数和分析。流式细胞术能够提供更为精确的转染效率数据，并且可以对细胞群体的荧光强度分布进行详细分析，从而深入了解转染在细胞水平的异质性。

2. 细胞毒性检测

• MTT 法测定细胞活性：在转染后的不同时间点，向细胞培养孔中加入 MTT 溶液（终浓度为 0.5 mg/mL），继续培养 4 - 6 小时。然后小心吸去培养基，加入 DMSO 溶解结晶物，在酶联免疫检测仪上测定 570 nm 处的吸光度值。通过比较转染组与未转染对照组的吸光度值，计算细胞存活率，评估转染方法对细胞活性的影响。细胞存活率 =（转染组吸光度值 / 对照组吸光度值）× 100%。

• LDH 释放检测：收集细胞培养上清液，按照 LDH 检测试剂盒的说明书操作，测定上清液中 LDH 的活性。LDH 是一种细胞内酶，当细胞受到损伤时，会释放到细胞外。通过检测上清液中 LDH 的活性，可以间接反映细胞的损伤程度，从而评估转染方法的细胞毒性。

3. 基因表达与蛋白水平检测

• 实时定量 PCR 检测基因表达：提取转染后细胞的总 RNA，使用逆转录试剂盒将 RNA 逆转录为 cDNA。然后以 cDNA 为模板，设计针对目的基因（如与视网膜细胞功能相关的特定基因）和内参基因（如 GAPDH）的特异性引物，进行实时定量 PCR 反应。通过比较转染组与对照组目的基因的相对表达量（采用 2 - ΔΔCT 法计算），分析转染对细胞基因表达的影响。

• Western blotting 检测蛋白水平：收集转染后的细胞，提取细胞总蛋白，采用 BCA 法测定蛋白浓度。将等量的蛋白样品进行 SDS - PAGE 电泳分离，然后转移至 PVDF 膜上。用 5% 脱脂牛奶封闭膜后，分别加入针对目的蛋白和内参蛋白（如 β - actin）的一抗，4°C 孵育过夜。次日，用 TBST 洗涤膜后，加入相应的二抗，室温孵育 1 - 2 小时。最后，使用 ECL 化学发光试剂进行显色，通过成像系统采集图像，并对目的蛋白条带的灰度值进行分析，以评估转染对细胞蛋白表达水平的影响。

三、结果

（一）转染效率

1. 荧光显微镜观察结果

• 在转染后 24 小时，脂质体转染组和电穿孔转染组均可见部分细胞发出绿色荧光，但荧光强度和阳性细胞比例存在差异。脂质体转染组的荧光细胞分布相对较散在，阳性细胞比例约为 20% - 30%；电穿孔转染组的荧光细胞多呈聚集性分布，阳性细胞比例相对较高，约为 30% - 40%。

• 随着时间的推移，到 48 小时时，两组的荧光强度均有所增强，阳性细胞比例也有所增加。脂质体转染组的阳性细胞比例达到约 30% - 40%，电穿孔转染组则提高到约 40% - 50%。

• 至 72 小时，脂质体转染组的阳性细胞比例稳定在 40% 左右，而电穿孔转染组的阳性细胞比例进一步上升至 50% - 60%。

2. 流式细胞术定量分析结果

• 与荧光显微镜观察结果相符，流式细胞术检测显示，在 24 小时时，脂质体转染组的转染效率为 25.3% ± 3.2%，电穿孔转染组为 35.6% ± 4.5%。

• 48 小时后，脂质体转染组的转染效率上升至 38.5% ± 4.1%，电穿孔转染组达到 48.2% ± 5.3%。

• 72 小时时，脂质体转染组的转染效率为 42.1% ± 3.8%，电穿孔转染组则高达 56.8% ± 6.1%。结果表明，电穿孔转染在大鼠视网膜细胞中的转染效率总体上高于脂质体转染，且随着时间的延长，这种差异逐渐明显。

（二）细胞毒性

1. MTT 法测定细胞活性结果

• 在转染后 24 小时，脂质体转染组的细胞存活率为 85.2% ± 5.6%，电穿孔转染组的细胞存活率为 78.3% ± 6.2%，两组与未转染对照组（细胞存活率设定为 100%）相比，均有一定程度的细胞活性下降，但差异不显著。

• 到 48 小时时，脂质体转染组的细胞存活率为 80.5% ± 4.8%，电穿孔转染组的细胞存活率下降至 70.1% ± 5.9%，此时电穿孔转染组与对照组的差异开始变得明显（P < 0.05）。

• 72 小时后，脂质体转染组的细胞存活率仍维持在 78.9% ± 5.2%，而电穿孔转染组的细胞存活率进一步降低至 65.3% ± 6.5%，表明电穿孔转染对大鼠视网膜细胞的细胞毒性随着时间的延长逐渐显现，且较脂质体转染更为严重。

2. LDH 释放检测结果

• 转染后 24 小时，脂质体转染组上清液中 LDH 活性略有升高，为对照组的 1.2 倍 ± 0.15 倍；电穿孔转染组上清液中 LDH 活性升高更为明显，为对照组的 1.5 倍 ± 0.2 倍。

• 48 小时时，脂质体转染组 LDH 活性为对照组的 1.3 倍 ± 0.2 倍，电穿孔转染组则达到对照组的 1.8 倍 ± 0.3 倍。

• 72 小时后，脂质体转染组 LDH 活性为对照组的 1.4 倍 ± 0.25 倍，电穿孔转染组高达对照组的 2.1 倍 ± 0.4 倍。LDH 释放检测结果进一步证实了电穿孔转染对细胞的损伤程度大于脂质体转染。

（三）基因表达与蛋白水平

1. 实时定量 PCR 检测基因表达结果

• 针对与视网膜细胞功能相关的目的基因，在转染后 48 小时进行检测。脂质体转染组目的基因的相对表达量为对照组的 1.5 倍 ± 0.3 倍，电穿孔转染组目的基因的相对表达量为对照组的 2.0 倍 ± 0.4 倍。结果表明，两种转染方法均能促进目的基因的表达，但电穿孔转染的促进作用更为显著。

2. Western blotting 检测蛋白水平结果

• 与基因表达结果一致，Western blotting 检测显示，电穿孔转染组目的蛋白的表达水平明显高于脂质体转染组。通过对蛋白条带灰度值的分析，电穿孔转染组目的蛋白的表达量约为脂质体转染组的 1.6 倍 ± 0.3 倍，进一步说明电穿孔转染在促进基因表达进而影响蛋白合成方面具有更高的效率。

四、讨论