在细胞培养过程中，支原体污染是一个常见且棘手的问题。支原体是一类极其微小的微生物，缺乏细胞壁，呈高度多形性，能够在不知不觉中潜入细胞培养体系，对细胞的生长、形态和功能等方面产生诸多不良影响。因此，准确判断细胞是否被支原体污染至关重要，这关系到实验结果的准确性和可靠性。以下将详细介绍几种判断细胞是否被支原体污染的方法。
一、观察细胞形态和生长特征
支原体污染严重时，可引起细胞生长减慢、培养基pH变酸、细胞病变等特征。通过观察细胞的形态和生长特征，可以初步判断是否存在支原体污染。
细胞体积变化：支原体的寄生可能影响细胞的正常代谢和渗透压调节，导致细胞体积异常。一些细胞可能会变得肿胀，边缘模糊不清；而另一些细胞则可能变小。
细胞形态不规则：原本应该呈多边形或梭形等典型形态的细胞，在支原体污染后可能会变得扭曲、变形，失去其正常的几何形状。
细胞质颗粒增多：支原体感染可能引发细胞内代谢紊乱，导致细胞质中出现较多的颗粒状物质，使细胞质看起来不再清澈透明。
生长速度异常：健康细胞在适宜的培养条件下具有相对稳定的生长速度。但被支原体污染后，细胞的生长速度可能会明显加快或减慢。
二、检测细胞代谢产物
支原体的代谢活动可能会影响细胞培养体系中某些代谢产物的含量。例如，支原体可能会消耗培养基中的葡萄糖、氨基酸等营养物质，导致其含量下降速度加快；同时，支原体还可能产生一些特殊的代谢产物，如乳酸、氨等，使培养基的酸碱度发生变化。通过定期检测培养基中这些物质的含量和酸碱度变化，可以间接推断细胞是否被支原体污染。
三、微生物学检测方法
培养法
将细胞培养上清液接种到适宜的支原体培养基中，在特定的温度和气体环境下进行培养。如果培养基中出现支原体的菌落形态，如“煎蛋样”菌落，则可以初步判断细胞被支原体污染。然而，这种方法培养周期较长，通常需要数天甚至数周的时间，且灵敏度相对较低。
DNA荧光染色法
采用特定的荧光染料，如Hoechst 33258等，这些染料能够与支原体的DNA特异性结合。将细胞进行染色处理后，在荧光显微镜下观察。如果发现细胞周围或内部存在着点状或丝状的荧光信号，就提示可能存在支原体污染。这种方法相对快速、灵敏，但也可能会出现假阳性结果，需要结合其他方法进行验证。
PCR检测法
聚合酶链式反应（PCR）技术是一种高效的检测手段。通过设计针对支原体特异性基因序列的引物，对细胞样本中的DNA进行扩增。利用凝胶电泳分析扩增产物，可以判断是否存在支原体污染。这种方法灵敏度高、特异性强，且检测周期短，是目前常用的检测方法之一。
电子显微镜观察
利用电子显微镜或免疫电镜对样本进行观察，可以直观地看到支原体的形态和分布。这种方法准确性较高，但受条件限制，且检测时间长，敏感性不高。
四、预防措施
为了降低细胞被支原体污染的风险，需要采取一系列预防措施：
严格遵循实验室清洁和消毒程序，确保实验环境的无菌状态。
使用合格的器皿和耗材，避免使用有破损或污染的器皿。
防止空气污染，尽量减少不必要的进出实验室，避免引入外来微生物。
严格控制实验室人员的卫生，保持良好的个人卫生习惯。
定期对实验室环境和设备进行检测，以确保没有微生物滋生。
支原体污染对细胞培养的质量和实验结果的可靠性构成严重威胁。因此，需要综合运用多种方法来判断细胞是否被支原体污染，包括观察细胞形态和生长特征、检测细胞代谢产物、微生物学检测方法等。同时，还需要采取预防措施来降低污染风险，确保实验结果的准确性和可靠性。只有这样，才能为科学研究和临床诊断提供坚实的技术支持。
