摘要
为了实现由RNA干扰(RNAi)途径介导的有效的治疗性转录后基因沉默，必须对小干扰RNA(siRNA)进行化学修饰。几种具有稳定siRNA代谢潜力的超RNA结构已被评估其诱导基因沉默的能力，但它们都有局限性或尚未在治疗相关背景下进行探索。共价闭合环状RNA转录物在真核生物中普遍存在，具有作为生物标志物和疾病靶点的潜力，环状RNA模拟物正在被探索用于治疗。在这里，我们报道了小环状干扰RNA(sciRNAs)的合成和评价。为了合成sciRNA，用三价N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)配体功能化并使用“click”化学环化的正义链被退火成反义链。这种策略用于合成小圆环，但也可用于合成较大的环状RNA模拟物。我们在体外和体内评估了各种sciRNA设计。我们观察到循环后正义链的代谢稳定性得到改善，脱靶效应被消除。反义链的5'-(E)-乙烯基膦酸盐修饰导致GalNAc-sciRNA在体内的治疗相关剂量有效。物理化学研究和基于核磁共振的结构分析，以及分子模型研究，揭示了这类具有部分双链特征的新型siRNA与RNAi机制的相互作用。
图1 (A) sciRNA中使用的化学修饰。(B) GalNAc -偶联sciRNA示意图。
图2 sciRNA-GalNAc偶联物点击环正义链的合成。简称:Q, 6-叠氮己基柄; Y: 炔羟基脯氨酸磷酰胺; L, GalNAc配体; Z, 连接子。
表1 线性GalNAc-siRNA和环状GalNAc-siRNA的序列、热稳定性和体外效力。
正义链序列是最上面的行;反义链序列为底行。Z表示环状寡核苷酸。化学修饰如下：•，PS键; 小写的核苷酸，2'-OMe; 大写的核苷酸用斜体表示，2'-F; Q,6-azidohexyl-phosphate; 副VP,5'-(E)-vinylphosphonate。
血浆和肝脏匀浆中寡核苷酸稳定性分析
用10倍辅助因子溶液稀释大鼠血浆(BioIVT,Cat# RAT00PL38NCXNN)和肝脏匀浆(BioIVT，定制订单)，最终浓度为1mM MgCl2, 1mM MnCl2和2mM CaCl2。将sciRNA加入到50μl的血浆或肝脏匀浆中，最终浓度为20μg/ml。反应混合物在37℃下轻摇孵育。在每个预定时间点(0,1,4,8和24h)，加入450μL含有内标(寡核苷酸U21，终浓度为1μg/ml)的Clarity OTX裂解上样缓冲液(Phenomenex,Cat# AL0-8579)停止反应，并在-80°C冷冻至分析。实验一式三次。
使用Liu等人(49)描述的Clarity OTX 96孔固相萃取板进行LC-MS分析的寡核苷酸富集。固相萃取柱初始用1 ml甲醇，然后用2ml 50mM醋酸铵和2mM在HPLC级水中平衡。样品通过正压加载到固相萃取柱上。然后用1ml 50mM乙酸铵在50/50(v/v)水和乙腈(pH5.5)中洗涤5次。最后，用含有10mM EDTA, 100mM碳酸氢铵的洗脱缓冲液在40/10/50(v/v/v)乙腈/四氢呋喃/水(pH8.8)中洗脱寡核苷酸。洗脱液在氮气下干燥，重悬于120μl LC-MS级水中进行LC-MS分析。
结果
大鼠血浆和肝脏匀浆已被用于表征GalNAc偶联寡核苷酸的代谢。在长达8小时的血浆中检测到环状或线性siRNA链均未降解(图4A)。然而，在我们的LC-MS代谢物分析中，我们观察到在大鼠血浆中孵育24小时后，环状链上增加了一个水分子。从大鼠肝脏匀浆或血浆中鉴定si-4的代谢物见补充表S4，从大鼠肝脏匀浆或血浆中鉴定si-5的代谢物见补充表S5。我们的理论认为，这种物种是由于开放的环状结构产生线性化的寡核苷酸。在大鼠肝脏匀浆中，环形sciRNA(si-4和si-5)比线性sciRNA(si-3)更稳定。在24h时si-4或si-5没有降解，而对于si-3，在24h时仅检测到全长正义链的约55%(图4B)。与具有4小时半衰期的线性siRNA相比，sciRNA的半衰期明显更长，为29和30小时。这与单链稳定性分析的结果有关，其中环化增强了外切酶存在下的稳定性。在肝脏匀浆中，我们没有观察到si-4或si-5的正义链的环状结构打开。
图4 线性GalNAc-siRNA si-3和GalNAc-sciRNAs与环状正义链si-4和si-5在血浆和肝脏匀浆中孵育后全长正义链的稳定性使用LC-MS测量。(A)大鼠血浆或(B)大鼠肝脏匀浆中剩余全长正义链百分比(log10)。用误差条表示每个时间点三个重复的标准差。
结论
作为RNAi疗法，sciRNAs可以提供包括代谢稳定在内的有益特性，从而延长作用时间，减少脱靶结合。进一步的环状RNA结构可以设计成定制的三维结构，从而影响组织分布和组织保留，最大限度地减少不希望的蛋白质结合，并优化由于物理性质变化而导致的配体-受体相互作用。在RNAi治疗的当前前景中，许多已批准的药物和人类临床试验中的高级候选药物已经优化为靶向递送到肝脏。类似的药物设计规则是否会普遍适用于siRNA成功递送到肝外组织和各种相关细胞类型，还有待观察。沿着这些具有挑战性的路线工作，需要探索新的化学和结构修饰类别。了解结构基序对效力和安全性的影响将为未来开发细胞和组织特异性递送RNAi疗法铺平道路。具有修饰结构的siRNA也将扩展RNAi疗法的工具箱，当将脱靶减少和增强代谢稳定纳入初始RNAi筛选过程时，将提供额外的益处。
