薄膜过滤微生物测试法
一、培养皿的准备
1.配备与待测样品数相同的无菌培养皿,另上一个作对照组(每种培养剂一个对照组),在每个培养皿上标上待测样品的记号
2.用烧过的镊子将无菌吸收垫从包装袋中取出,放入每个培养皿中,每取一个吸收垫,镊子需用火烧一次
3.打开培养皿盖子到刚能加上约1.8m1的培养剂在吸收垫上,强烈建议使用装有培养剂的小安瓿瓶、小瓶或小管,当处理大量样品时,可使用无菌的吸管来分配培养剂
二、培养剂的种类:
总菌数 橙血清培养剂
酵母和霉菌数 橙血清培养剂
大肠杆菌数 MF-Endo培养剂
粪便大肠杆菌数 M-FC培养剂
4.应有足够的培养剂加入每个培养皿,使过滤膜能适当地粘附着吸收垫。但过多的培养剂会引起菌落扩展重叠,常常得不到正确的计数结果。有需要时,建议调整推荐的培养剂数,以便粘附和菌落生长。
三、过滤器支架的准备:
1.打开预先灭菌的过滤器支架或将过滤器座、漏斗和漏斗盖在沸水中浸没一分钟作消毒。若没有沸水,用95%酒精喷洒于漏斗和漏斗盖,然后将其点燃,在火熄灭以后,让过滤器冷却至40℃以下,如果必须使用酒精,漏斗必须用耐火材料制造。
2.用水煮过或火焰灭菌钳子,将无菌过滤器的底座部分安装于过滤烧瓶或真空管道上。
3.用火烧过的镊子放一张无菌薄膜在过滤器底座上,根据测试目的,使用特定的过滤膜:
总菌数/大肠杆菌数:0.45um薄膜
酵母菌和霉菌:0.80um薄膜
4.用水煮过或火焰灭菌钳子,将过滤器漏斗和漏斗盖放置于底座上。如漏斗盖带有管口,则在管口处装上过滤器,或予以封住。待过滤器的温度低于40℃后才可加样品。
5.重复以上步骤,直到所有样品都完成过滤。
四、样品的过滤和平板培养
1.无菌地将样品直接倒入消毒和冷却的过滤器漏斗中。盖上过滤器漏斗的盖子。若使用勺须将勺放在95%的酒精的烧杯中。
2.施加真空,使样品通过薄膜。无菌地打开装有无菌水的玻璃瓶,先用火烧螺纹处,然后倒入约20毫升无菌水于过滤漏斗内,进行冲洗。施加真空,使无菌水通过薄膜。在过滤完样品或无菌水后,不要让真空施加时间连续超过30秒以上。
3.用火焰灭菌钳子从过滤器底座上取下薄膜。轻微提起装有吸收垫和培养剂的培养皿的盖子,并放下薄膜,直到镊子相对侧的薄膜边靠到吸收垫边为止。将薄膜贴在吸收垫上滚动,以排除气泡。盖上盖子,在工作台上轻轻拍打培养皿,以驱除薄膜下面的气泡。
4.作为对照组,用无菌水代替样品重复上述过滤和平板培养程序。每一种培养剂须制备个空白培养皿。
五、样品培养
1.为了防止在过滤膜表面形成冷凝水,所有培养皿必须倒置于培养箱中。
2.在培养箱中放置一烧杯水,以维持适当的湿度。
3.在以下温度下培养可以得到的结果:
总菌数 35℃
酵母菌和霉菌数 28℃
大肠杆菌数 35℃
注:只能使用一次性的培养皿,不能使用重复用的培养皿。
六、菌落数的计算
1.总菌数
必须分别在培养24小时和72小时后计算菌数。点计所有菌落(不管类型),并记录高数目
2.酵母菌和霉菌数
在培养48小时后,计点酵母菌和霉菌数,并在此后每隔24小时再计点一次,直到过第五天,记录高数目。
酵母菌通常为圆形的白色菌落。有时他们也带有颜色。在一天至两天后,一些酵母菌菌落的中心因吸收培养剂而变成蓝色。
霉菌菌落会显示不同颜色(包括白色、黄色、红色、蓝色和黑色),但从“绒毛状”或“棉花状”外观很容易辨认这种菌落。通常霉菌菌落比细菌或酵母菌的菌落为大。
细菌菌落通常比酵母菌更快吸收指示剂,而其颜色会变成蓝色、绿色、蓝绿色或褐色。再这种培养剂中,细菌菌落比一般酵母菌小。
3.大肠杆菌数
大肠杆菌菌落呈绿色或墨绿色,并有明显的金属光泽。在培养24小时后,只计算有“金属光泽”的菌落。
一、培养皿的准备
1.配备与待测样品数相同的无菌培养皿,另上一个作对照组(每种培养剂一个对照组),在每个培养皿上标上待测样品的记号
2.用烧过的镊子将无菌吸收垫从包装袋中取出,放入每个培养皿中,每取一个吸收垫,镊子需用火烧一次
3.打开培养皿盖子到刚能加上约1.8m1的培养剂在吸收垫上,强烈建议使用装有培养剂的小安瓿瓶、小瓶或小管,当处理大量样品时,可使用无菌的吸管来分配培养剂
二、培养剂的种类:
总菌数 橙血清培养剂
酵母和霉菌数 橙血清培养剂
大肠杆菌数 MF-Endo培养剂
粪便大肠杆菌数 M-FC培养剂
4.应有足够的培养剂加入每个培养皿,使过滤膜能适当地粘附着吸收垫。但过多的培养剂会引起菌落扩展重叠,常常得不到正确的计数结果。有需要时,建议调整推荐的培养剂数,以便粘附和菌落生长。
三、过滤器支架的准备:
1.打开预先灭菌的过滤器支架或将过滤器座、漏斗和漏斗盖在沸水中浸没一分钟作消毒。若没有沸水,用95%酒精喷洒于漏斗和漏斗盖,然后将其点燃,在火熄灭以后,让过滤器冷却至40℃以下,如果必须使用酒精,漏斗必须用耐火材料制造。
2.用水煮过或火焰灭菌钳子,将无菌过滤器的底座部分安装于过滤烧瓶或真空管道上。
3.用火烧过的镊子放一张无菌薄膜在过滤器底座上,根据测试目的,使用特定的过滤膜:
总菌数/大肠杆菌数:0.45um薄膜
酵母菌和霉菌:0.80um薄膜
4.用水煮过或火焰灭菌钳子,将过滤器漏斗和漏斗盖放置于底座上。如漏斗盖带有管口,则在管口处装上过滤器,或予以封住。待过滤器的温度低于40℃后才可加样品。
5.重复以上步骤,直到所有样品都完成过滤。
四、样品的过滤和平板培养
1.无菌地将样品直接倒入消毒和冷却的过滤器漏斗中。盖上过滤器漏斗的盖子。若使用勺须将勺放在95%的酒精的烧杯中。
2.施加真空,使样品通过薄膜。无菌地打开装有无菌水的玻璃瓶,先用火烧螺纹处,然后倒入约20毫升无菌水于过滤漏斗内,进行冲洗。施加真空,使无菌水通过薄膜。在过滤完样品或无菌水后,不要让真空施加时间连续超过30秒以上。
3.用火焰灭菌钳子从过滤器底座上取下薄膜。轻微提起装有吸收垫和培养剂的培养皿的盖子,并放下薄膜,直到镊子相对侧的薄膜边靠到吸收垫边为止。将薄膜贴在吸收垫上滚动,以排除气泡。盖上盖子,在工作台上轻轻拍打培养皿,以驱除薄膜下面的气泡。
4.作为对照组,用无菌水代替样品重复上述过滤和平板培养程序。每一种培养剂须制备个空白培养皿。
五、样品培养
1.为了防止在过滤膜表面形成冷凝水,所有培养皿必须倒置于培养箱中。
2.在培养箱中放置一烧杯水,以维持适当的湿度。
3.在以下温度下培养可以得到的结果:
总菌数 35℃
酵母菌和霉菌数 28℃
大肠杆菌数 35℃
注:只能使用一次性的培养皿,不能使用重复用的培养皿。
六、菌落数的计算
1.总菌数
必须分别在培养24小时和72小时后计算菌数。点计所有菌落(不管类型),并记录高数目
2.酵母菌和霉菌数
在培养48小时后,计点酵母菌和霉菌数,并在此后每隔24小时再计点一次,直到过第五天,记录高数目。
酵母菌通常为圆形的白色菌落。有时他们也带有颜色。在一天至两天后,一些酵母菌菌落的中心因吸收培养剂而变成蓝色。
霉菌菌落会显示不同颜色(包括白色、黄色、红色、蓝色和黑色),但从“绒毛状”或“棉花状”外观很容易辨认这种菌落。通常霉菌菌落比细菌或酵母菌的菌落为大。
细菌菌落通常比酵母菌更快吸收指示剂,而其颜色会变成蓝色、绿色、蓝绿色或褐色。再这种培养剂中,细菌菌落比一般酵母菌小。
3.大肠杆菌数
大肠杆菌菌落呈绿色或墨绿色,并有明显的金属光泽。在培养24小时后,只计算有“金属光泽”的菌落。
