背景
靶向治疗癌症一直是科研界研究抗癌的一个关键领域。ERK与MYD88之间的相互作用已被证明对于RAS依赖的细胞转化和癌细胞存活至关重要。因此，抑制ERK-MYD88相互作用可能成为一种有效的癌症治疗策略。然而，现有的ERK激酶抑制剂往往会导致癌细胞的适应性反应和耐药性，这就需要探索新的治疗策略。
法国里昂癌症研究中心Toufic Renno、Isabelle Coste团队在Nature Communications杂志发表了题为“Targeting ERK-MYD88 interaction leads to ERK dysregulation and immunogenic cancer cell death”的研究论文。在这项研究中，研究人员利用瑞孚迪（Revvity） HTRF PPI（蛋白-蛋白互作）试剂从66000个小分子中发现一种苯并咪唑类化合物EI-52能通过破坏ERK-MYD88相互作用诱导癌细胞特异性免疫原性细胞凋亡，从而杀死肿瘤细胞并激活抗肿瘤T细胞反应发挥抗肿瘤作用。并且利用瑞孚迪Quantum GX2 microCT评价了其在活体动物水平对于肿瘤细胞治疗效果。
结果
1瑞孚迪HTRF PPI试剂助力ERK-MYD88相互作用抑制小分子EI-52的鉴定和表征
研究人员首先通过瑞孚迪均相时间分辨荧光 (HTRF) PPI（蛋白-蛋白互作）试剂分析筛选了约66,000个小分子，寻找能够破坏MYD88蛋白D结构域与ERK蛋白的D募集位点之间相互作用的分子,其筛选仪器采用瑞孚迪多功能酶标仪EnVision。初步筛选出75种化合物，并根据理化性质和构效关系进行，最终选择了苯并咪唑和螺环两类具有相似活性的化合物进行进一步开发。苯并咪唑化合物EI-52（图1A）通过荧光猝灭（图1B）和HTRF实验（图1C）显示其与ERK1和ERK2结合，并抑制ERK与MYD88的相互作用。为确定EI-52在ERK上的结合位点，研究人员使用P2Rank预测引擎，识别出一个可能的结合槽 (Zone A) (图1D) ，其包含多个重要的芳香族和带负电的残基。进一步计算模型显示，EI-52的二甲氨基苯基基团可能与Zone A的天冬氨酸和谷氨酸残基（ERK2中的D316、D319、E79）相互作用，SP-26作为对照化合物也显示了类似的结合模式。研究人员在细胞实验中通过双分子荧光互补 (BiFC) 测定（图1E）和邻位连接测定 (PLA) (图1F) 验证了EI-52抑制ERK-MYD88相互作用，并确认ERK上的319位天冬氨酸对该结合至关重要（图1G）。研究结果表明，EI-52可以直接与ERK蛋白的D募集位点结合并有效抑制ERK-MYD88的相互作用。
图1：EI-52抑制ERK-MYD88蛋白-蛋白相互作用并诱导癌细胞死亡[1]
2小分子EI-52抑制剂可诱导癌细胞死亡
先前研究表明ERK-MYD88相互作用对癌症的持续存在至关重要，因此研究人员探讨了EI-52对癌细胞存活的影响。将人结肠癌细胞HCT116 (K-RasG13D) 暴露于8 μM的EI-52或相同浓度的ERK激酶抑制剂，48小时后，EI-52显著诱导了癌细胞死亡（图1H），而ERK激酶抑制剂处理后无明显细胞死亡。螺环化合物SP-26同样诱导了HCT116细胞死亡。流式细胞术显示，HCT116细胞经EI-52处理24小时后，磷脂酰丝氨酸暴露，表明细胞死亡为凋亡性（图1I）。研究人员进一步评估了几十种EI-52类似物对ERK-MYD88相互作用的抑制能力及诱导癌细胞死亡的效果。构效关系 (SAR) 研究表明，一些类似物功能上与EI-52相似，而另一些则无效，这排除了EI-52生物活性是由苯并咪唑骨架非特异性效应引起的可能性，并为后续药物优化提供了基础。研究人员还扩展了分析，测试了Oncopanel™集合中的301个细胞系对EI-52的反应。结果显示，80%的细胞系对EI-52表现出中等敏感性（IC50为3.4到11 µM），10%表现出高敏感性（IC50低于3.4 µM），另10%表现出低或无敏感性（IC50高于11 µM）（图2A）。不同肿瘤类型对EI-52的反应存在异质性（图2B）。与其他63种抗肿瘤参考化合物相比，EI-52的敏感性模式，表明其具有作用机制（图2C）。
图2：EI-52的活性在机理上是且与肿瘤类型无关[1]
3瑞孚迪Quantum FX microCT助力E1-52在活体小鼠抗肿瘤活性评价
为了研究EI-52在体内的抗肿瘤活性，研究人员在同系Lewis肺癌 (LLC) 模型中进行了测试。体外实验确认，EI-52以IC50 = 4 μM的浓度诱导LLC细胞凋亡。腹腔内 (i.p.) 给药的药代动力学研究显示，EI-52的生物利用度为52.9%，AUC为1129 ng/ml/h，适合用于概念验证研究。在LLC小鼠模型中，EI-52通过i.p.给药表现出剂量依赖性抑制肿瘤生长的效果（图3A）。在Kras-LA2自发性肺肿瘤模型中，通过瑞孚迪Quantum GX2 microCT扫描EI-52治疗10周后显著减少了肺部肿瘤负荷（图3B），且未见肝脏、肾脏或脾脏的毒性迹象。此外，EI-52在鸡胚胎绒毛尿囊膜 (CAM) 模型中未显示出急性毒性，进一步支持了其在体内的安全性。研究人员还研究了EI-52在离体人类肿瘤中的抗癌效果。患者来源的结肠和肺肿瘤类器官在EI-52处理48小时后显示出凋亡迹象（图3C）。在头颈癌切片的离体模型中，EI-52处理导致肿瘤细胞中强c-PARP染色，显示其肿瘤特异性（图3D）。综上所述，EI-52通过抑制ERK-MYD88蛋白相互作用，能够有效诱导人类癌细胞的凋亡，而无明显毒性。
图3：使用EI-52抑制ERK-MYD88蛋白相互作用触发免疫原性癌细胞死亡和抗肿瘤T细胞反应[1]
4E1-52抑制ERK-MYD88蛋白相互作用诱导癌细胞死亡和抗肿瘤T细胞反应
为了解EI-52对整体转录活性的影响，研究人员使用Affymetrix芯片分析了HCT116细胞在EI-52处理16小时后的基因表达情况，发现NF-κB依赖的炎症基因表达上调（图4A），包括趋化因子（图4B），这些基因的表达在RNA（图4C）和蛋白质水平上得到了证实（图4D）。与MEK激酶抑制剂U0126不同，EI-52处理激活了NF-κB、CXCL1和CXCL8的转录（图4E）。p65敲低实验显示NF-κB在IL-8分泌中的关键作用（图4F）。同时，EI-52处理后p65和ERK在HEK293T细胞中发生免疫共沉淀（图4G），表明ERK蛋白复合体发生变化，可能带来不同的生物学效应。濒死癌细胞产生趋化因子被认为是免疫原性细胞死亡 (ICD) 程序的一个指标。EI-52诱导的细胞死亡伴随着ATP和HMGB1的释放（图4H），这些分子具有趋化活性，能够吸引THP1巨噬细胞（图4I）。而U0126未引起ICD介质的产生或HCT116细胞对巨噬细胞的趋化作用（图4H，I）。这些结果突显了ERK激酶活性抑制与ERK-MYD88蛋白相互作用抑制之间的功能差异。在体内研究中，腹腔注射EI-52 24小时后，肿瘤中检测到240-440 ng/g的药物浓度，肿瘤细胞表现出显著的PARP裂解（图5A，B），表明系统性给药EI-52可有效暴露肿瘤并迅速引发癌细胞的凋亡。研究人员还探讨了T细胞对EI-52抗肿瘤活性的可能贡献。结果显示，EI-52处理仅在裸鼠中略微减缓肿瘤生长，在T细胞功能正常的小鼠中，EI-52表现出更强的抗肿瘤效果，表明其能诱导免疫反应（图5C）。此外，EI-52与抗PD1抗体联合使用，显著提高了抗肿瘤疗效（图5D）。
图4：EI-52在体外诱导免疫原性癌细胞死亡[1]
图5：EI-52抑制ERK-MYD88相互作用在体内诱导癌细胞死亡和免疫T细胞反应[1]
总结
在这篇报告中，研究人员介绍了两类化合物（螺环和苯并咪唑类），它们通过作用于ERK蛋白的D募集位点区域，破坏ERK与MYD88的相互作用并扰乱ERK复合物，从而在体内引发早期免疫原性凋亡和抗肿瘤T细胞反应。虽然ERK-MYD88蛋白相互作用抑制剂EI-52对癌细胞的具体分子效应仍需进一步研究，但ERK伴侣蛋白的非典型调控、细胞死亡动力学及细胞系敏感性谱均指向一种作用机制。研究人员的研究表明，EI-52会导致活化的ERK错误定位，并伴随综合应激反应，引起细胞凋亡。
这些研究结果表明，通过抑制ERK-MYD88相互作用可能是一种有前景的癌症治疗方法。寻找靶向该相互作用的疗法有望成为抗击癌症的关键。
在这项研究中，瑞孚迪公司的先进技术和仪器发挥了至关重要的作用。
瑞孚迪整体药物研究解决方案
采用HTRF PPI试剂搭配EnVision多功能酶标仪进行高通量化合物筛选、靶点功能验证，从66000化合物中成功找到能阻断ERK-MYD88结合小分子E1-52。
采用EnVision多功能酶标仪超敏化学发光进行了细胞增殖实验的检测。
利用Quantum GX2 microCT进行E1-52动物活体水平肺部肿瘤治疗评价。
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Quantum GX2活体microCT系统能够在不处死动物的情况下对每一只动物模型进行多个时间点的连续观察而不用担心辐射剂量问题。Quantum GX2使用快速成像的CMOS平板检测器，能够缩短成像时间，同时利用回顾性的呼吸门控可以避免肺部呼吸造成的运动伪影，是在活体水平对肺相关疾病进行评价的利器。
