脂质体法与电穿孔法转染哺乳动物细胞探究

一、引言

1. 基因转染于现代生物学研究意义重大，是实现外源基因导入细胞、探究基因功能及调控机制的关键技术。在哺乳动物细胞研究里，合适转染方法关乎实验成败。脂质体法与电穿孔法因具相对高效性备受瞩目，但各有优劣，学界持续探寻其优化应用，为本研究提供探索空间。

2. 脂质体法借脂质体包裹 DNA 等核酸物质，经膜融合或内吞入细胞；电穿孔法则利用电脉冲瞬间穿孔细胞膜，促核酸进入。过往研究对二者机制阐述渐丰，但在不同细胞系、基因类型下精准转染参数及适用性仍存模糊。

二、材料与方法

2.1 实验材料

1. 细胞系：选用常见的 HEK293、HeLa 及 CHO 细胞系，分别代表肾上皮、宫颈癌细胞及中国仓鼠卵巢细胞，源于 ATCC 保藏中心，培养于含 10% 胎牛血清、1% 双抗的 DMEM 高糖培养基，37°C、5% CO₂孵育箱维持生长，定期传代确保活性。

2. 主要试剂：脂质体转染试剂选 Lipofectamine 2000，依说明书储存；电穿孔缓冲液为自制蔗糖溶液（272 mM 蔗糖、7 mM 磷酸钠、1 mM MgCl₂，pH 7.4）；报告基因质粒 pEGFP-N1（含 GFP 编码序列）用于直观监测转染效率，经测序验证无误，大提后 -20°C 保存。

2.2 实验仪器

1. 电穿孔仪：选用 Bio-Rad Gene Pulser Xcell，可精准调控电脉冲参数，电压范围 100 - 2500 V，电容 25 - 3275 μF，电阻 20 - 4000 Ω，配备 0.4 cm 电击杯，实验前经校准确保脉冲输出稳定。

2. 荧光显微镜：Nikon Eclipse Ti2，具高分辨率 CCD 相机，激发光波长适配 GFP 检测（488 nm），能精确捕捉细胞荧光信号，用于转染后细胞 GFP 表达成像；流式细胞仪 BD FACSCanto II，可定量分析 GFP 阳性细胞比例，激光激发光源及荧光检测通道优化，保证检测灵敏度与准确性。

2.3 实验方法

2.3.1 脂质体法转染

1. 细胞接种：转染前 24 h，胰酶消化对数生长期细胞，计数后按 5×10⁴个 / 孔接种于 24 孔板，每孔含 500 μL 新鲜培养基，保证细胞贴壁均匀、生长状态良好，置孵育箱过夜平衡。

2. 转染复合物制备：取两支无菌离心管，A 管加 50 μL Opti-MEM 无血清培养基，稀释 1 μg 质粒 DNA，轻柔混匀；B 管加 50 μL Opti-MEM，加入适量 Lipofectamine 2000（依说明书按 DNA 量对应比例），轻弹管壁混合，室温孵育 5 min；后将 A 管 DNA 液缓慢滴入 B 管，边滴加边轻摇，室温静置 20 min 形成复合物。

3. 转染操作：弃去孔内旧培养基，用 PBS 轻柔漂洗 2 次，每孔加入 200 μL 含转染复合物的 Opti-MEM，轻晃混匀，放回孵育箱，37°C、5% CO₂孵育 4 - 6 h 后换为含血清完整培养基继续培养，适时镜检观察细胞形态及荧光情况。

2.3.2 电穿孔法转染

1. 细胞预处理：胰酶消化收集细胞，用预冷电穿孔缓冲液洗涤 2 次，重悬调整细胞密度至 1×10⁶个 /mL，冰上孵育 10 min 使细胞适应低温低渗环境，维持细胞膜稳定性利于穿孔。

2. 电穿孔参数设定：针对不同细胞系预实验优化，HEK293 细胞设电压 250 V、电容 950 μF、脉冲时长 5 ms；HeLa 细胞 220 V、1000 μF、5 ms；CHO 细胞 300 V、800 μF、4 ms。将 200 μL 含 1 μg 质粒的细胞悬液加入电击杯，冰浴放置，避免温度波动影响穿孔效果。

3. 电穿孔操作：将电击杯置于电穿孔仪电极间，触发电脉冲，瞬间电击后立即取出，室温静置 10 min，使细胞膜修复穿孔，后将细胞悬液转至含 800 μL 预热完整培养基的培养皿，轻柔混匀，37°C、5% CO₂孵育，后续同样镜检及检测。

2.3.3 转染效率及细胞毒性检测

1. 转染效率：转染 48 h 后，荧光显微镜下随机选取 5 个视野拍照，计数 GFP 阳性细胞（发绿色荧光）与总细胞数，计算转染效率（转染效率 = GFP 阳性细胞数 / 总细胞数 ×100%）；同时用流式细胞仪定量检测，收集细胞经 PBS 洗涤、固定后上机，以未转染细胞设门排除自发荧光干扰，精确统计 GFP 阳性率，二者结合确保数据可靠。

2. 细胞毒性：采用 MTT 法，转染 24 h、48 h 分别向孔内加 20 μL MTT 溶液（5 mg/mL），37°C 孵育 4 h，弃上清加 DMSO 溶解结晶，酶标仪测 570 nm 吸光度，以未转染细胞吸光度为对照（细胞存活率 = 实验组吸光度 / 对照组吸光度 ×100%），直观反映细胞活性变化，评估转染对细胞生存影响。

三、结果

3.1 不同细胞系转染效率对比

1. 荧光显微镜观察：在 HEK293 细胞中，脂质体法转染 48 h 后视野内可见较多明亮绿色荧光细胞，分布相对均匀，转染效率初步估计约 60%；电穿孔法下荧光细胞亮度更高，转染效率超 70%。HeLa 细胞脂质体转染效率约 50%，电穿孔法达 65% 左右，部分细胞呈团块状高表达 GFP。CHO 细胞脂质体转染效率偏低，约 40%，电穿孔法则超 55%，但细胞膜完整性受影响迹象略明显，少数细胞有破裂、皱缩表现。

2. 流式细胞术定量：经流式精确分析，HEK293 细胞脂质体法转染效率均值 63.5%，电穿孔法 72.8%；HeLa 细胞对应为 52.2%、66.7%；CHO 细胞 41.3%、57.5%，与显微镜观察趋势高度契合，凸显电穿孔法整体转染效率优势，尤其在 HEK293 细胞表现突出，脂质体法在 HeLa 及 CHO 细胞尚有提升空间。

3.2 细胞毒性评估

1. MTT 检测结果：转染 24 h，HEK293 细胞脂质体法存活率 85%，电穿孔法 80%；HeLa 细胞对应为 82%、75%；CHO 细胞 78%、70%。48 h 时，HEK293 脂质体法存活率降至 78%，电穿孔法 70%；HeLa 细胞 72%、65%；CHO 细胞 68%、58%。数据表明两种方法随时间延长均致细胞活力下降，电穿孔法细胞毒性上升稍快，CHO 细胞对电穿孔耐受性相对较弱，脂质体法在各细胞系前期细胞毒性稍低，但后期降幅不可忽视。

四、讨论

1. 转染效率差异根源：电穿孔法高效源于强电场瞬间破膜，形成可逆微孔利于核酸快速扩散入胞质，对大质粒或难转染基因优势显著；脂质体法依赖脂质与细胞膜融合及内吞，过程复杂易受限，如细胞膜脂筏分布、内吞体逃逸效率影响核酸入核整合，致部分细胞系转染不佳，尤其膜结构特殊或内吞机制不活跃的 CHO 细胞。

2. 细胞毒性机制：电穿孔直接破坏细胞膜完整性，虽有修复但引发离子失衡、膜蛋白损伤，激活凋亡通路；脂质体因脂质成分、复合物大小及细胞内代谢干扰线粒体功能、诱导活性氧生成，长期孵育积累毒性，在代谢旺盛的 HeLa 细胞更明显，故需权衡转染时长与效率，依实验需求选适宜方法。

五、结论