黑曲霉菌 pyrG 基因克隆与同源转化

一、引言

二、材料与方法

1. 黑曲霉菌株与培养条件

• 本实验所采用的黑曲霉菌株来源于特定的菌种保藏中心，具有典型的黑曲霉生物学特征。将黑曲霉菌株接种于含有特定营养成分（如葡萄糖、硫酸镁等）的培养基中，在适宜的温度（如 30°C）、湿度和通气条件下进行培养。通过定期观察菌落形态、菌丝生长状况等指标，确保菌株处于良好的生长状态，为后续实验提供高质量的模板材料。

2. pyrG 基因克隆

• 引物设计：基于黑曲霉已知的基因组序列信息，利用专业的生物信息学软件设计针对 pyrG 基因的特异性引物。引物的设计遵循引物长度适宜（一般 18 - 25bp）、GC 含量适中（40% - 60%）、避免二级结构形成以及在基因序列上具有特异性结合位点等原则。设计完成后，对引物进行合成并通过高效液相色谱法进行纯化，以保证引物的纯度和质量。

• 基因组 DNA 提取：采用改良的 CTAB 法提取黑曲霉基因组 DNA。首先，收集适量的黑曲霉菌丝体，在液氮中研磨成细粉，迅速转移至含有 CTAB 裂解缓冲液的离心管中。接着，在 65°C 水浴中孵育一段时间，期间适时轻柔混匀。然后，加入等体积的氯仿 / 异戊醇混合液，充分振荡混匀后离心，取上清液。重复氯仿 / 异戊醇抽提步骤以进一步纯化 DNA。最后，加入异丙醇沉淀 DNA，用 70% 乙醇洗涤沉淀，干燥后溶于适量的 TE 缓冲液中。通过琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测 DNA 的完整性和浓度。

• PCR 扩增：以提取的黑曲霉基因组 DNA 为模板，加入设计好的特异性引物、高保真 DNA 聚合酶、dNTPs 以及相应的 PCR 缓冲液，在 PCR 仪中进行扩增反应。反应条件经过优化，包括预变性温度（如 95°C，5min）、变性温度（95°C，30s）、退火温度（根据引物 Tm 值确定，一般 55 - 60°C，30s）、延伸温度（72°C，根据目的基因长度确定延伸时间，一般 1 - 2min/kb）以及循环次数（一般 30 - 35 个循环）。扩增结束后，取部分 PCR 产物在琼脂糖凝胶上进行电泳检测，观察是否有预期大小的条带出现。

3. 同源转化载体构建

• 选择合适的质粒载体（如具有多克隆位点、筛选标记基因等功能元件的载体），利用限制性内切酶对载体和扩增得到的 pyrG 基因片段进行双酶切。酶切反应体系中包含适量的限制性内切酶、缓冲液和 DNA 片段，在适宜的温度下孵育足够的时间。酶切完成后，通过琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物，利用胶回收试剂盒回收目的基因片段和线性化的载体片段。然后，在 T4 DNA 连接酶的作用下，将 pyrG 基因片段与线性化载体进行连接反应。连接反应在适宜的温度（如 16°C）下过夜进行，构建成同源转化载体。

4. 黑曲霉原生质体制备与转化

• 原生质体制备：收集处于对数生长期的黑曲霉菌丝体，用适当浓度的渗透压稳定剂（如 1.2M 山梨醇溶液）洗涤菌丝体。然后，加入含有特定细胞壁水解酶（如蜗牛酶、纤维素酶等混合酶液）的消化液，在适宜的温度（如 30°C）和振荡条件下进行细胞壁消化反应。每隔一段时间取样，在显微镜下观察原生质体的释放情况。当原生质体释放量达到一定比例时，通过过滤除去未消化的菌丝体残渣，再用渗透压稳定剂洗涤原生质体，最后将原生质体悬浮于适量的 STC 缓冲液中，调整原生质体浓度至合适范围（如 1×10⁷ - 1×10⁸/ml）。

• 转化反应：将构建好的同源转化载体与适量的黑曲霉原生质体混合均匀，加入 PEG 介导转化溶液，在冰上孵育一段时间（如 20 - 30min），然后迅速转移至 42°C 水浴中热激一定时间（如 5min）。热激结束后，迅速冷却至冰浴，加入适量的预冷的 STC 缓冲液和再生培养基，混匀后涂布于含有特定筛选剂（根据载体上的筛选标记基因确定，如潮霉素 B）的再生平板上。在适宜的培养条件下培养一段时间后，观察转化子的生长情况并进行筛选鉴定。

三、结果与分析

1. pyrG 基因克隆结果

• 通过 PCR 扩增得到的产物经琼脂糖凝胶电泳检测，在预期大小位置出现清晰的条带，表明成功扩增出 pyrG 基因片段。对 PCR 产物进行测序分析，结果显示与已知的黑曲霉 pyrG 基因序列具有高度的同源性，进一步验证了克隆的准确性。测序结果还可以用于分析基因序列中的一些特殊结构和变异情况，为后续研究其功能奠定基础。

2. 同源转化载体构建验证

• 对构建的同源转化载体进行酶切鉴定，得到与预期大小相符的片段，说明载体构建成功。将构建好的载体转化至大肠杆菌感受态细胞中，通过筛选阳性克隆并提取质粒进行再次酶切验证和测序分析，确保载体在大肠杆菌中能够稳定存在且序列正确，为后续黑曲霉的转化提供可靠的载体来源。

3. 原生质体制备与转化效果

• 在原生质体制备过程中，通过显微镜观察发现，随着消化时间的延长，原生质体逐渐从菌丝体中释放出来，在最佳消化时间时，原生质体释放率可达到 80% - 90%。经过转化操作后，在含有筛选剂的再生平板上出现了一定数量的转化子菌落。对转化子进行 PCR 验证，结果显示大部分转化子中成功整合了 pyrG 基因片段，表明同源转化取得了较好的效果。通过对转化子的生长特性、代谢产物合成等方面的初步分析，发现与野生型黑曲霉相比，部分转化子在某些性状上出现了明显的变化，进一步证明了 pyrG 基因同源转化对黑曲霉的遗传改造产生了影响。

四、结论与展望