电穿孔转染细粒棘球绦虫干扰 RNA 方法

一、引言

二、材料与方法

1. 细粒棘球绦虫的获取与预处理

• 细粒棘球绦虫原头蚴或幼虫样本来源于感染细粒棘球绦虫的动物肝脏或其他寄生部位。在无菌条件下，将获取的组织小心解剖，使用含有特定抗生素（如青霉素、链霉素）的生理缓冲液（如磷酸盐缓冲液，PBS）反复冲洗，以去除杂质和可能存在的细菌污染。然后，将虫体置于含有适量营养成分（如葡萄糖、氨基酸等）的培养液中，在特定的温度（如 37°C）和气体环境（如 5% CO₂）下培养一定时间，使虫体处于适宜的生理状态，以便后续电穿孔转染操作。培养过程中，定期观察虫体的活力和形态变化，通过台盼蓝拒染法等手段检测虫体的存活率，确保用于转染的虫体具有较高的活性。

2. 干扰 RNA 的设计与合成

• 根据已确定的细粒棘球绦虫靶基因序列，利用专业的 RNAi 设计软件（如 siDirect 等）设计特异性的干扰 RNA 序列。设计原则包括选择合适的靶位点（一般位于基因的编码区，避免在 5' 和 3' 非翻译区以及内含子区域）、确保序列的特异性（通过与基因组数据库进行比对，避免与其他非靶基因序列有同源性）以及考虑干扰 RNA 的二级结构（尽量减少自身形成复杂二级结构的可能性）。设计完成后，委托专业的生物公司进行化学合成。合成后的干扰 RNA 经过高效液相色谱法（HPLC）纯化，以去除杂质和可能存在的短片段 RNA。通过紫外分光光度计测定其浓度和纯度，将其溶解于无核酸酶的水或合适的缓冲液中，储存于 - 80°C 备用。

3. 电穿孔缓冲液的选择与优化

• 测试多种电穿孔缓冲液对细粒棘球绦虫的适用性，如不同离子强度（如低渗、等渗、高渗）的磷酸盐缓冲液、蔗糖缓冲液等。将虫体分别置于不同的缓冲液中，在相同的电穿孔条件（如电压、脉冲时间等暂设为固定值）下进行预实验。通过观察虫体在电穿孔后的存活率（采用活 / 死细胞染色试剂盒检测）以及后续培养中的生长状态，评估不同缓冲液对虫体的影响。选择能够在保证较高虫体存活率的同时，有利于干扰 RNA 进入虫体的缓冲液作为最终的电穿孔缓冲液，并进一步对其成分（如添加某些辅助因子，如二甲基亚砜，DMSO，以增强细胞膜的通透性）和浓度进行优化。

4. 电穿孔参数的确定与优化

• 采用电穿孔仪进行实验，首先对电压、脉冲时间、脉冲次数等电穿孔参数进行初步筛选。设置不同的电压梯度（如 100 - 500V）、脉冲时间范围（如 1 - 10ms）和脉冲次数（如 1 - 5 次）组合，将含有特定浓度干扰 RNA 的虫体悬液与电穿孔缓冲液混合后，加入电穿孔杯进行电穿孔操作。电穿孔后，将虫体转移至新鲜的培养液中培养一定时间，然后通过实时定量 PCR（qRT - PCR）检测靶基因的表达水平，以确定能够实现最高基因沉默效率的电穿孔参数组合。在优化过程中，还需要考虑不同参数之间的相互作用，例如，较高的电压可能需要较短的脉冲时间以减少对虫体的损伤，通过多因素实验设计（如正交实验）来全面评估参数的最佳组合。

5. 电穿孔转染及后续检测

• 将预处理后的细粒棘球绦虫虫体与适量的干扰 RNA（浓度根据预实验确定，一般在 10 - 100nM）混合于优化后的电穿孔缓冲液中，转移至电穿孔杯。按照优化后的电穿孔参数进行电穿孔操作。电穿孔完成后，立即将虫体转移至预热的含有丰富营养成分和抗生素的培养液中，在适宜的培养条件下（如 37°C、5% CO₂）培养。在不同的时间点（如 24 小时、48 小时、72 小时等）收集虫体，提取总 RNA，采用 qRT - PCR 技术检测靶基因的表达水平，以评估干扰 RNA 的基因沉默效果。同时，通过观察虫体的形态变化（如虫体大小、结构完整性等）、运动能力以及对宿主细胞的侵袭能力等表型变化，进一步验证基因沉默对虫体生物学特性的影响。此外，还可以采用 Western blotting 技术检测靶蛋白的表达水平，从蛋白水平验证干扰 RNA 的作用效果。

三、结果与分析

1. 电穿孔缓冲液优化结果

• 经过对多种电穿孔缓冲液的测试和优化，发现一种等渗的磷酸盐缓冲液添加一定浓度（如 0.5%）的 DMSO 时，虫体在电穿孔后的存活率较高，可达 80% 以上，且在后续培养中生长状态良好。与其他缓冲液相比，该缓冲液能够显著提高干扰 RNA 进入虫体的效率，通过荧光标记的干扰 RNA 转染实验观察到，在该缓冲液中，虫体内的荧光强度明显高于其他缓冲液组，表明其更有利于干扰 RNA 的导入。

2. 电穿孔参数优化结果

• 通过多因素实验设计优化电穿孔参数，确定了电压为 300V、脉冲时间为 5ms、脉冲次数为 3 次的组合能够实现最高的基因沉默效率。在该参数组合下，对靶基因进行 qRT - PCR 检测，结果显示与未转染组相比，转染后 48 小时靶基因的表达水平下降了约 80%。同时，随着时间的推移，基因沉默效果在 72 小时内能够维持相对稳定，之后逐渐有所回升，但仍显著低于未转染组。

3. 电穿孔转染效果评估

• 对电穿孔转染干扰 RNA 后的细粒棘球绦虫进行多方面检测，发现除了靶基因表达水平显著下降外，虫体在形态上出现了一些变化，如虫体体积变小、内部结构略显松散等。在运动能力方面，转染后的虫体运动速度明显减慢，运动范围也减小。对宿主细胞的侵袭能力检测表明，转染组虫体的侵袭能力较未转染组下降了约 60%。通过 Western blotting 检测靶蛋白表达水平，结果与 qRT - PCR 检测结果一致，进一步证实了干扰 RNA 通过电穿孔转染成功地沉默了靶基因，并对虫体的生物学特性产生了显著影响。

四、结论与展望