摘要：本文旨在介绍一种基于ICH Q14指南的有关物质分析方法开发流程，该方法利用ACD/AutoChrom 软件和统计学工具来开发HPLC分析方法和验证分析方法的耐用性范围。通过案例研究某主成分及其杂质的分析，展示了如何确保方法的专属性、准确度和灵敏度及确定合理的耐用性范围。
引言
在药物开发过程中，有关物质的分析是确保药品质量的关键步骤。ICH Q14指南提供了一个关于方法开发的框架，要求分析方法必须满足专属性、准确度和灵敏度等要求。本文通过某主成分的案例，详细描述了按照ICH Q14要求如何利用ACD / AutoChrom 软件和统计学方法来开发和验证HPLC分析方法。
方法开发范围及目的
目的：某主成分是一种原料药，本研究旨在开发一种分析方法，用于检测该主成分中的已知和未知杂质，确保产品质量。
开发范围：包括Imp. 1、Imp. 2、Imp. 3、Imp. 4、Imp. 5、Imp. 6等已知杂质以及未知杂质和总杂质。
分析目标概况
方法开发过程
知识准备和风险分析：
基于对化学结构、色谱知识及ACD/Labs软件对该产品的有关物质进行分析方法开发，确保各组分的专属性、灵敏度及准确性。
PH的确定：利用ACD/Labs软件预测该主成分及各杂质的log D
各组份在pH 0-11范围内log D均大于1，无保留的风险，且不受pH影响，考虑到大多数色谱柱的pH耐用性，pH确定为2.0~8.0范围。
检测波长的确定：使用DAD，获得各组份的DAD数据，如下图。
通过DAD图进行对比，选择230nm波长作为该分析方法的检测波长。
分析方法筛选部分：
色谱柱的选择：由于各组份主要结构差异为苯环上取代基，本次筛选了Inertsil ODS-3，Welch Xtimate C18, Phenomenex Kinetex-BiPhenyl，最终确定了Phenomenex Kinetex-BiPhenyl 作为本方法中的色谱柱。
流动相的选择：弱洗脱，本方法中pH的选择范围在2.0-8.0，经过筛选，选择0.1%磷酸溶液为弱洗脱。强洗脱，部分杂质的Log D约为5，经过筛选选择及乙腈作为流动相，梯度洗脱。
筛选获得的方法中发现有一个未知工艺杂质与不同已知杂质有较多的分离问题，是本方法的主要的专属性方面的风险。
色谱方法优化和初步鉴定：
1、使用一台仪器（A品牌），设计两个梯度，三个柱温（25℃、30℃、35℃）的两因素梯度优化实验
洗脱梯度 1：
洗脱梯度 2：
根据以上条件得到的图谱，使用 AutoChrom 软件进行建模，模型如下：
从模型分析，随着柱温的升高以及更缓（增加一个梯度拐点）的洗脱梯度，未知杂质出峰位置会相对主峰、Imp.2和 Imp.3发生较大后移。在柱温40℃及以下洗脱梯度（表一）时，未知杂质出峰在Imp.3后，分离较好（软件中显示分离度：4.4），且柱温耐用性范围较宽（可达±5℃），故以柱温40℃和表一梯度作为初步确认的中心点实验条件，在相同品牌不同设备编号的仪器上进行方法确认实验。
表一：梯度表（柱温40℃）
2、使用中心点实验条件在相同品牌不同设备编号的仪器上进行重现，图谱如下：
不同设备编号实验结果表：
解析：仪器2与仪器3实验结果，Imp.3与未知杂质实际分离度和软件模拟结果重现度高，而仪器1相对另外两台仪器，主峰保留时间提前了近两分钟，同时Imp.3与未知杂质分离最差。其原因可能与泵和管路的差异有关。
3、为了确保后续方法在不同仪器能有较好的重现性，在分离最差的仪器（仪器1）上重新进行梯度温度双因素建模，设计洗脱梯度和三个柱温（25℃、35℃、45℃）进行两因素实验以建立数据模型， 洗脱梯度如下表：
洗脱梯度 1：
洗脱梯度 2：
根据以上条件得到的图谱进行建模，模型如下：
基于仪器1上的建立的新模型，并比较在原方法开发的仪器上建立的模型，重新调整中心点的位置到柱温35℃及以下洗脱梯度（表二）。此时未知杂质与Imp.3分离较好（软件预测分离度：5.2），且柱温耐用性范围较宽（可达±5℃），故以柱温35℃和表二梯度作为中心点实验条件，在仪器1上进行实验。
表二：梯度表（柱温35℃）
4、使用中心点实验条件在相同品牌不同设备编号的仪器上进行重现
仪器1上中心点实验加杂溶液（主成分：1mg/ml，各杂质：1μg/ml）图谱如下：
解析：经过实验发现，Imp.3 与未知杂质实际分离度为：5.7，和软件模拟重现度好，结合原模型获得的空间，调整中心点，确定使用该梯度条件及柱温为 35℃。
方法耐用性范围的确定：
利用AutoChrom 软件进行耐用性预测，并使用统计学软件（JMP）对方法参数的范围和相互作用进行探索，建立耐用性空间。
下表展示了选取的变化因素及高低水平的设置，在AutoChrom 软件中预测出如下条件变化产生243个实验组合的最小分离度。
利用JMP对方法参数的范围和相互作用进行探索，将AutoChrom 软件中模拟出243个实验的最小分离度导入统计学软件（JMP），进行处理得到如下结果：
解析：由预测值-实际值图可以得出，本数据模型RSq值为0.95，模型准确度较高，故AutoChrom 软件模拟预测出的243个实验结果具有参考意义，上表设定的条件范围为耐用性空间范围；由预测刻画器图可以看出，有机相起始比例、有机相终止比例、柱温和流速对于分离度有影响，其中柱温的影响是显著的，由模型数据和统计学处理结果可以初步确定本方法在柱温35℃，流速为1.2ml/min，洗脱梯度为如下表格。
在此数据模型下，探索统计学软件（JMP）对于方法开发阶段的帮助，在预测刻画器中，使用设计空间刻画器，设置我们所需要达到的低分离度，可以得到我们满足分离要求的空间，由于本方法模型数据均符合分离要求，在此设计一个较大的分离度要求（分离度≥2.5）
解析：在设计空间刻画器中可以看到，模型数据中满足分离度要求（分离度≥2.5）的条件占比在97.56%，如需找到一空间使所有分离度均≥2.5，可继续内移。
解析：在内移至所有条件均满足分离度要求（分离度≥2.5）时，此时的方法为耐用性范围为：有机相起始比例（28±1%）、有机相终止比例（32±1%）、梯度洗脱时间（25±1min）、柱温（30~37℃）及流速（1.2±0.1ml/min）；在此基础上将限值发送到模拟器对耐用性范围进行验证。
解析：由模拟器模拟后得到，耐用性范围与设计空间刻画器一致。
从实际出发，以实验为基础来论证本方法耐用性空间，在对分离影响较大的各个因素中取边界点，利用统计学软件进行实验设计，设计出12针处于耐用性空间边界的12个色谱条件，如下表格：
并且在仪器1进行实验，实验数据如下：
解析：在耐用性空间边界点的12个色谱条件下，Imp.3与未知杂质分离均较好，主峰及其他已知杂质与相邻峰分离也较好。
为了进一步确保此方法在不同品牌仪器间差异，再从统计学软件设计的12个色谱条件中选择序号1、2、3、7、9和10色谱条件（每个因素的高低水平都各有三个实验条件，相当于也是均匀分布在耐用空间上的6个点），在不同品牌仪器进行实验，图谱如下：
解析：在不同品牌仪器中，6个色谱条件下，主峰和已知杂质与相邻峰分离均较好，本方法耐用性空间建立成功。
耐用性范围为：有机相起始比例（28±1%）、有机相终止比例（32±1%）、梯度洗脱时间（25±1min）、柱温（35±5℃）及流速（1.2±0.1ml/min）。
结论
本研究成功开发了一种基于ICH Q14的HPLC分析方法，用于某主成分及其杂质的检测。利用ACD/ AutoChrom 软件和统计学工具，优化了色谱条件，确保了方法的专属性、准确度和灵敏度，并建立了方法的耐用性空间。
Kinetex Biphenyl
• 出色的分离能力
• 耐用且可靠
• 100 % 水溶液稳定
具备 C18 无法提供的选择性！
不仅仅只是高性能和强保留，Kinetex Biphenyl 还拥有传统 C18 色谱柱无法媲美的能力。可提供具有固定相的核-壳颗粒所带来的高性能，这种固定相能够为反相方法开发中改善选择性的优选。使用 Kinetex Biphenyl 色谱柱可增强保留能力，获取更高的灵敏度和整体结果；尤为适合芳香族化合物的分析。
芳香族 π-π 相互作用
在联苯基的芳环和目标分子的芳环以及 π 电子之间
疏水性相互作用
发生在 Biphenyl 配体的碳骨架与目标分析物之间
弱离子或偶极-偶极相互作用
双环结构产生的高电子密度能够发挥类似于弱阳离子交换剂的作用，从而增强碱性分析物的保留能力。
