免疫荧光技术（Immunofluorescence，IF）又称荧光抗体技术，是标记免疫技术中发展最早的一种。它是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质和定位。
原理：免疫荧光技术是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素，制成荧光抗体，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检测组织或细胞内的相应抗原（或抗体）。在组织或细胞内形成的抗原抗体复合物上含有标记的荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受外来激发光的照射而发生明亮的荧光（黄绿色或橘红色），可以看见荧光所在的组织细胞，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。
一、操作步骤：
1、细胞准备：对单层生长细胞，在传代培养时，将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片，PBS洗两次；对悬浮生长细胞，取对数生长细胞，用PBS离心洗涤（1000rpm,5min）2次，用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。
1、固定：根据需要选择适当的固定剂固定细胞。固定完毕后的细胞可置于含叠氮纳的PBS中4℃保存3个月。PBS洗涤3×5 min.
2、通透：使用交联剂（如多聚甲醛）固定后的细胞，一般需要在加入抗体孵育前，对细胞进行通透处理，以保证抗体能够到达抗原部位。选择通透剂应充分考虑抗原蛋白的性质。通透的时间一般在5-15min.通透后用PBS洗涤3×5 min.
3、封闭：使用封闭液对细胞进行封闭，时间一般为30min.
4、一抗结合：室温孵育1h或者4℃过夜。PBST漂洗3次，每次冲洗5min.
5、二抗结合：间接免疫荧光需要使用二抗。室温避光孵育1h.PBST漂洗3次，每次冲洗5min后，再用蒸馏水漂洗一次。
二、优缺点：
优点：
1、高灵敏度：免疫荧光技术对抗原的检测具有很高的灵敏度，即使在极微量的抗原存在下也能进行检测。
2、高特异性：由于抗体与抗原的特异性结合，免疫荧光技术可以准确地定位和检测特定的蛋白质或抗原。
3、可视化：该技术允许直接在细胞或组织中观察靶标抗原，提供了直观的视觉信息，有利于了解抗原的分布和定位。
4、双重标记：可以同时使用两种不同的荧光标记抗体，以在同一样本中检测两种不同的抗原，这对于共定位研究非常有用。
5、适用性广：免疫荧光技术广泛应用于生物学和医学研究，包括疾病诊断、细胞分选、蛋白质相互作用和细胞生物学研究。
6、可定量：通过测量荧光强度，可以对抗原表达进行定量分析。
7、快速：一旦制备好样品和抗体，免疫荧光实验通常可以在几小时内完成。
缺点：
1、信号衰减：荧光信号会随时间衰减，尤其是在长时间曝光于激发光下，这要求在实验过程中及时捕获图像。
2、非特异性背景：可能会发生非特异性结合，需要通过适当的封闭和对照实验来减少背景信号。
3、荧光淬灭：在某些条件下，荧光标记可能会淬灭，影响结果的可靠性。
4、需要特殊设备：免疫荧光显微镜和相关设备相对昂贵，可能不是所有实验室都能配备。
5、样品制备：样品固定和处理过程可能影响抗原的检测，需要仔细优化条件。
6、不能保存长久：由于荧光信号会随时间衰减，因此无法长期保存样品进行复查。
7、有限的多重分析能力：尽管可以进行双重或多重标记，但可用的荧光通道数量有限，这限制了同时检测不同抗原的数量。
8、解释主观性：结果的解释可能具有主观性，依赖于观察者对荧光信号的识别和解释。
9、光毒性：长时间的光照可能对活细胞造成损伤，影响细胞生理状态。
