纯化后的蛋白质和肽的水解-化工仪器网-手机版

蛋白质和肽”是指从生物反应器或纯化过程得到的相对纯净的样品。这些样品几乎或完全不含其他非蛋白质物质。让完整蛋白质或肽生成游离氨基酸，是获取有用且准确的氨基酸分析数据的关键步骤。要生成游离氨基酸，必须将蛋白质/肽分解或水解为单个氨基酸组分。

本节介绍了气相及液相蛋白质和肽水解的基本步骤，着重介绍实现出色分析应考虑的基本要点。

附加的子小节介绍了其他可选的水解方法，采用这些方法可分析含标准盐酸水解技术无法水解的氨基酸（色氨酸和半胱氨酸/胱氨酸）的特殊样品。

2.1 蛋白质的酸水解

本节重点介绍制备氨基酸样品十分常用的方法 - 盐酸水解法。无论采用哪种方法，要想完全水解蛋白质样品，必须考虑几个因素。预估方法时应考虑使用哪种中和缓冲液，以及是否存在任何固体。此外，由于水解速率或程度会因蛋白质所含的氨基酸而异，因此需要对水解过程进行时程研究，并适当地验证整体方法。在水解过程中正确处理样品有助于获得高质量的结果。这类分析中最常见的问题通常源于选用的技术不适合，或者技术本身性能不达标。要使用这种方法进行有效的水解，首先必须回答四个问题：

样品是否需要稀释？
水解管中应分配多少样品？
水解管中具体应添加多少体积的酸（仅限液相水解）？
如果此阶段要使用内标，用量是多少？

以下各个小节概述了必要的测定步骤，并适时提供了示例计算。

2.1.1 基本考虑要点

应保证水解样品中含有2–25 µg蛋白质（除非样品量有限），以便尽量减少污染的影响。无论采用哪种水解模式，都建议保证20 µg的蛋白质含量。

样品中不应含有多余的固体物质。固体物质会干扰气相水解。
如果样品中含有其他固体，则在计算样品浓度（每单位体积酸对应的固体）时，应将固体质量与蛋白质质量相加。
水解所用的酸的净浓度应约为6 N。
相较于外标，更推荐使用内标（例如正缬氨酸(Nva)）。
内标应在水解之前添加。如果适用，可以在样品制备过程中添加内标，或者将其添加到酸中，然后将酸添加到水解管中。通常根据校正所用的标准品量来计算内标量。
水解所用的酸中需要添加苯酚作为除氧剂。

2.1.2 液相水解前的样品稀释（如果需要）

水解管中应添加至少10 µL样品（稀释或不稀释）。如果样品量小于10 µL，体积的不确定性会导致不可接受的误差量。
水解时，酸必须过量，质量达到样品质量的10–100倍。浓度过高的样品可能无法有效水解。在这种情况下，必须稀释样品。确保液相水解液中酸的质量达到固体质量的大约100倍。
确保样品中酸的摩尔量达到缓冲液摩尔量的25倍。将磷酸盐缓冲液的摩尔量乘以3，可得到三个可滴定组的摩尔量。
水解总体积不得超过水解管或容器总容量的50%。对于6 × 50 mm的水解管，建议的最大水解体积为100 µL。这个最终总体积包括酸体积和内标体积。

计算示例：确定稀释要求

现有溶于150 mM NaCl溶液，浓度为5 mg/mL的蛋白质样品，需要计算该样品的固体量（包括盐）和稀释因子。

步骤1：确定样品中的固体总量。

第一步是确定样品中的固体总量。将蛋白质浓度(µg/µL)乘以盐的重量浓度（浓度 × 分子量）可得到固体总量。

步骤2：计算将样品稀释至含有20 µg目标质量的稀释比例。

下一步是确定将样品稀释至含有20 µg蛋白质（溶于20 µL溶液中）所需的稀释比例。将目标量/目标体积乘以样品浓度的倒数即可得到稀释比例。通过计算可知，得到上述样品所需的稀释比例为1:5。

2.1.3 分配到水解管中的样品体积

推荐的水解总体积为100 µL（使用6 × 50 mm水解管时），其中样品体积在10–20 µL范围内。样品体积（无论是否稀释）取决于水解的类型，应遵循如下指南：

气相水解：将样品真空干燥，水解管底部会形成一层薄膜。
液相水解：分配适量样品以便在水解管中水解至少2 µg蛋白质，或者从使用足量0.1 N盐酸复溶的更大量样品（最多25 µg蛋白质）中移取约0.2 µg蛋白质（理想情况下体积为10 µL）进行水解。

需要再次强调的是，样品中的蛋白质含量越低，分析就越容易受到污染。

2.1.4 加入水解体系的酸体积

加入水解体系中的酸的体积非常关键，对于液相水解来说尤其如此。确定酸体积的指南如下（附带一个示例）。

气相水解：

在水解容器底部加入200 µL 6 N盐酸（含0.1%–0.5%苯酚）。（如果使用商用水解工作站，请添加供应商推荐的体积。更多信息请参阅第4节和第5节。）

液相水解（见下文示例）：

确保酸的最终浓度为6 N（添加苯酚）。
确保酸的摩尔量过量（约25倍），足以中和缓冲液。
确保酸相较于固体总质量过量约100倍。此估计值中应包括蛋白质以及样品基质和其他固体的量。

计算示例：确定加入液相水解体系中的酸体积

按照上述指南，加入水解体系的最小酸量相较于缓冲液浓度须过量25倍，相较于样品重量须过量100倍。因此，要确定所需的酸体积，必须计算以下内容：

现有缓冲液的量
中和（25倍）样品中的缓冲液所需的酸量
将酸的量换算为体积
样品中的固体总量
相较于样品量过量100倍所需的最小酸量
将酸的量换算为体积
所需的总酸量（中和所需的酸量与过量酸量之和）

对于浓度为2.1 mg/mL，溶于2 mM Na/K₂PO₄的蛋白质样品：

步骤1：确定每管中缓冲液的量。

将缓冲液的摩尔浓度乘以可滴定组的数量（三组磷酸盐缓冲液），然后将体积调整为分配样品的总体积（在本例中为10 µL），可得到每个管中缓冲液的量。

每管含60 nmol缓冲液。

步骤2：确定相较于缓冲液过量25倍的酸量。

接下来，将每管中的缓冲液量乘以25，得到过量25倍的酸量。

这是能够有效中和缓冲液的酸的摩尔量。

步骤3：确定中和每个管中的样品缓冲液所需的6 N盐酸体积（将摩尔量换算为体积）。

接下来，必须将中和缓冲液所需的酸的摩尔量换算为加入管中的酸的体积。

对于该样品，0.25 µL 6 N盐酸可有效中和缓冲液。

步骤4：确定每管中的固体总量（蛋白质 + 缓冲盐）。

要计算相较于样品量过量100倍的酸量，必须先确定样品中的固体总量。固体总量是蛋白质、缓冲盐以及所有其他固体物质的总和。本例中的样品是纯化后的蛋白质。

将蛋白质浓度(µg/µL)乘以盐的重量浓度（浓度 × 分子量）可以得到固体总量。

计算得出该样品的固体总量为24.9 µg。

步骤5：计算每管中相较于样品量过量100倍的盐酸总量。

为确定过量100倍的目标酸量，将固体总量乘以100。

步骤6：将每管中过量酸的质量换算为6 N盐酸的体积。

最后，将酸的质量除以酸的摩尔质量，再除以酸的体积摩尔浓度，可以将过量酸的质量换算为需要向每管中添加的6 M盐酸的体积。

在本例中，相较于样品量过量100倍所需的6 M盐酸体积为11.4 µL。

步骤7：加入每管中的6 N盐酸的最终体积（步骤3 + 步骤6）。

添加到每管中的酸的最终体积是中和样品缓冲液的酸体积与相较于样品量过量100倍的酸体积之和：

确保有效水解所需的6 M盐酸的体积为11.65 µL。该体积可四舍五入为方便精确移液的体积。

2.1.5 内标(IS)

使用内标(IS)可很好地补偿样品中各氨基酸可能发生的水解。正缬氨酸(Nva)是最常用的内标。

使用内标时请注意：

内标可以加入样品中进行制备并随样品分配。
内标可以与样品分开添加。
内标可以添加到酸中进行制备并随酸分配。
确保将内标制备为仪器上进样1 µL内标对应的柱上进样量与进样1 µL样品对应的柱上进样量相同。

要确定起始样品中所需的内标量，请从最终样品中的内标量进行反向计算。衍生化步骤很重要，应视作计算的一部分。

计算示例：确定样品中内标的量

步骤1：确定每管的内标总量。

通过反向计算来确定内标总量：用最终样品中所需的内标量乘以衍生化样品的稀释因子和水解管中的复溶样品的稀释因子。在本例中，最终衍生化样品中需要25 pmol内标，在衍生化过程中，样品被稀释了10倍，在衍生化之前，样品被稀释了5倍。因此：

计算表明水解样品中需要1250 pmol内标。

步骤2：将内标摩尔浓度换算为质量。

使用MW (mg/mol)进行计算并将体积由μL换算为mL，我们可以计算得出，每mL起始样品中需要加入0.14 mg内标。

2.1.6 气相酸水解

气相水解推荐用于几乎或完全不含颗粒物、相对纯净的蛋白质或肽样品。气相水解被视为灵敏度非常高的方法。这种水解方法是独立、自动化的水解工作站的首选方法。水解过程中的真空控制、温度维持、氮气吹扫和样品干燥等操作最好由自动化系统来执行，如第4节所述的Eldex水解工作站。

试剂：

含1%（体积比）苯酚的6 N盐酸
氮气（预纯化级）
干冰

注：有关试剂的详细信息，请查阅水解工作站的操作手册。

流程（使用自动化工作站）：

在6 x 50 mm水解管中干燥含有0.5–20 µg蛋白质的样品。
向真空瓶底部加入含0.5%苯酚的200 µL恒沸盐酸（参见下文“提示”）。
交替执行三个真空-氮气吹扫循环后，在真空条件下密封真空瓶。
在112–116 °C下水解24 h。
冷却真空瓶；用实验室纸巾擦拭水解管外多余的盐酸；在真空下干燥。

提示：

使用结晶苯酚，在真空瓶底部放置一粒晶体（约 0.5 mg）。结晶苯酚比液体苯酚更纯净、更稳定。
小心地将样品和内标移取到水解管底部；使用注射器可确保移液准确性且方便操作。
您可以用锉刀或钻石尖笔在水解管上刻上记号。
防止盐酸液滴进入水解管内。保持真空瓶中的水解管直立。如果水解管少于10–12个，请增加空白水解管作为支撑。在冷却过程中稍微倾斜真空瓶可能会有所帮助。

注：水解后，盐酸通常会变成棕色。棕色来自苯酚。乙醇或丙酮能很好地去除真空瓶内部和顶部的变色。

注意：水解问题和衍生化问题可能难以区分。

2.1.7 液相酸水解

样品比较复杂时，通常采用液相水解法。这种情况下，存在可能干扰气相水解的颗粒或其他异物。此方法的总体灵敏度较低，但如果谨慎精准地执行，也能得到良好的结果。

此方法所需的设备与试剂如下：
分析天平
可维持设定温度±0.1 °C的恒温箱或加热器
涡旋混合器
移液管
可调节的微量移液管
带盖的水解管，推荐尺寸为6 × 50 mm
吹扫用的氮气源
6 N盐酸

流程：

开始前 -

称取相当于约20 mg蛋白质的样品（精确至0.1 mg）至水解管中，或将稀释后的样品转移至水解管中（参见第2.1.3节和第2.1.4节的计算结果）。总体积通常为10 µL。混合。

向水解管中精确加入第2.1.5节计算出的内标体积。混合。
添加过量的6 N盐酸（第2.1.4节步骤3计算出的体积），混合后用氮气吹扫30 s。立即加盖。
在110 °C恒温箱中放置24 h。（这些参数应通过目标蛋白质和氨基酸的时程研究确定。）
从恒温箱中取出水解管并待其冷却。
接下来可进入样品衍生化步骤。

2.1.8 酸水解的故障排除

某些氨基酸可能会受到水解不当的影响。例如：

不当的水解过程往往会导致蛋氨酸(Met)和酪氨酸(Tyr)的产率低 - 例如盐酸不纯或去氧不充分。这两个问题中的任何一个都可能导致氯的形成，进而导致Tyr的氯化。
疏水性氨基酸（Ile、Leu、Val等）的产率低可能表示水解不完全，其原因可能是恒温箱温度过低、水解时间过短（特别是对于快速、高温水解）或者由于氮气吹扫后过度排空造成了盐酸损失（这可能是针对特定样品的问题；某些氨基酸序列非常耐水解，如Ile-Val-Leu）。在将真空瓶放入恒温箱之前，请确认瓶中有肉眼可见的盐酸。盐酸过多也可能造成问题；液体会在样品中浓缩并生成棕色残留物，导致Tyr和Met损失，以及出现杂散峰。
如果不使用气相水解工作站，请确保充分设置好水解实验。恒温箱必须能容纳整个真空瓶；使用只能容纳瓶身下半部分的加热器将导致液态盐酸在顶部凝结，水解将无效。

2.2 色氨酸(Trp)分析

Trp在常用的6 N盐酸水解条件下不稳定，因此蛋白质和肽中Trp的分析较为复杂。可以使用如下的替代水解方法生成完整的Trp以供分析：

磺酸水解（例如，甲磺酸和对甲苯磺酸）
碱水解法以及在盐酸中添加硫醇试剂（如β-巯基乙醇(BME)或巯基乙酸）的方法

2.2.1 用于色氨酸分析的甲磺酸(MSA)水解法

MSA试剂必须直接加入6 × 50 mm样品管（液相水解），因为这种酸不会挥发。加入甲醇以及水解后的中和步骤可使色氨酸获得良好的产率，并且不会干扰任何后续的衍生化过程。图2为MSA与蛋白质的反应图解。

图2.用于Trp分析的MSA水解法

注：本方法也可用于Cys和Met的测定。它将Cys转化为Cya，将Met转化为蛋氨酸砜。

注：Tyr和Trp在通常用于Cys和Met分析的过甲酸氧化法中不稳定。

2.2.1.1 设备和试剂

含0.2%(w/v)色胺盐酸盐的4 M MSA
超纯水
甲醇-水-三乙胺(2:2:1)
水解管(6 × 50 mm)
真空干燥装置
水浴或加热器

2.2.1.2 流程

向每个装有干燥样品的6 × 50 mm水解管中加入20 µL含0.2%(w/v)色胺盐酸盐的4 M MSA。
向反应瓶中加入100 µL水。
密封反应瓶以便进行水解。
在110 °C下水解20–24 h。
冷却后，打开反应瓶，然后向每个水解管中加入22 µL 4 M KOH（足以中和管中的酸）。
在真空下干燥。
接下来即可对样品进行衍生化。

提示：

应使用对照空白样品检查是否存在干扰。

使用新鲜、纯净的MSA。
通常在市售酸中用作添加剂的色胺可能会对Tyr或Val造成干扰。使用不含添加剂的MSA可解决此问题。
使用新鲜的KOH（如果实验室的NaOH更纯净，也可以使用NaOH代替）。使用试验样品测试碱中和酸的能力。加入的碱体积应使过量碱保持在最低限度。
用水制备浓度为2.5 µmol/mL的Trp标准样。将样品冷冻保存。将Trp标准样与H标准样1:1混合以供校正使用。

注意：

可能会干扰Tyr和Val的测定。原因不明。（盐酸更适用于Tyr水解。）
Met产率低是水解条件导致的结果。
Trp和Met的产率并非线性，这是水解过程而不是分析过程决定的。产率随水解量减少而下降；水解量对Met的影响更显著。
Arg的结果重复性差 - 原因不明。

2.2.2 用于色氨酸分析的碱水解法

如果色氨酸的酸水解会引起稳定性问题，可使用蛋白质碱水解法作为替代方法。

2.2.2.1 设备和试剂

NaOH
乙酸
超纯水
水解管(6 × 50 mm)
真空干燥装置
水浴或加热器

2.2.2.2 碱水解法流程

碱水解可能需要使用塑料（例如Teflon）管，防止硅酸盐的形成以及后续的溶解问题或衍生化问题。
按照上述MSA水解流程，直接向水解管中加入20 µL新鲜的4 M NaOH。
密封水解管，在112 °C下加热16 h。
冷却后用过量乙酸中和。
接下来即可对样品进行衍生化。
运行空白样品，确定污染水平。
使用标准品和已知样品验证方法。

2.3. 用于分析含硫氨基酸（半胱氨酸、胱氨酸和蛋氨酸）的水解方法

图3.含硫氨基酸

蛋白质样品中的半胱氨酸(Cys)在标准酸水解条件下不稳定，因此半胱氨酸的定量较为复杂。遗憾的是，与Trp水解不同，半胱氨酸的替代酸水解或碱水解法效果并不理想。Cys分析的两种常见的方法都需要将半胱氨酸转化为更稳定的衍生物。第一步是巯基的烷基化，第二步是将其氧化成酸稳定的磺酸、磺基丙氨酸或三聚氰酸(Cya)。

警告：Cys分析的另一个复杂之处在于，大部分氨基酸以半胱氨酸二聚体 - 胱氨酸(Cys2)的形式存在，在进行任何烷基化处理之前，必须先将其还原为半胱氨酸。

需要注意的是，这个特殊处理过程应在标准酸水解步骤之前执行。

2.3.1 使用过甲酸氧化法对半胱氨酸、胱氨酸和蛋氨酸进行脱酰胺化处理