碧云天活性氧检测试剂盒说明书

一、产品简介

活性氧检测试剂盒(Reactive Oxygen Species Assay Kit，也称ROS Assay Kit)是一种利用荧光探针DCFH-DA进行活性氧检测的试剂盒。DCFH-DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透细胞膜，从而使探针很容易被装载到细胞内。细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF。检测DCF的荧光就可以知道细胞内活性氧的水平。

碧云天代理——天津益元利康生物科技有限公司

本试剂盒提供了活性氧阳性对照试剂Rosup，以便于活性氧的检测。Rosup是一种混合物(compound mixture),浓度为50mg/ml。使用本试剂盒检测细胞内活性氧的效果请参考图1。
图1. 碧云天活性氧检测试剂盒(S0033)检测L929 (小鼠成纤维细胞)细胞内活性氧的效果图。L929细胞装载DCFH-DA探针后用50μg/ml Rosup处理30分钟，随后PBS洗涤一次后用荧光显微镜(图A)检测。正常的L929细胞中探针几乎未被氧化成荧光化合物，细胞中的绿色荧光非常弱；使用活性氧阳性对照试剂Rosup处理使细胞内活性氧生成大幅增加，DCFH-DA与活性氧反应，细胞中的绿色荧光显著增强。实际结果会因实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，图中效果仅供参考。
本试剂盒本底低，灵敏度高，线性范围宽，使用方便。
本试剂盒S0033S包装可以测定100-500个样品，S0033M包装可以测定500-2500个样品。

包装清单：

二、保存条件：
-20℃保存，一年有效。
三、注意事项：
探针装载后，一定要洗净残余的未进入细胞内的探针，否则会导致背景较高。
探针装载完毕并洗净残余探针后，可以进行激发波长的扫描和发射波长的扫描，以确认探针的装载情况是否良好。DCF的激发光谱和发射光谱请参考下页图谱。
尽量缩短探针装载后到测定所用的时间(刺激时间除外)，以减少各种可能的误差。
荧光酶标仪检测时须使用适合荧光检测的黑板或白板，推荐使用碧云天BeyoGold™全黑96孔细胞培养板(FCP966)或BeyoGold™黑色透明底96孔细胞培养板(平底带盖, 独立包装) (FCP965)。
本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

四、使用说明：
1. 装载探针
对于刺激时间较短(通常为2小时以内)的细胞，先装载探针，后用活性氧阳性对照或自己感兴趣的药物刺激细胞。对于细胞刺激时间较长(通常为6小时以上)的细胞，先用活性氧阳性对照或自己感兴趣的药物刺激细胞，后装载探针。
原位装载探针：本方法仅适用于贴壁培养细胞。按照1:1000用细胞外液(C0216)或酌情使用PBS、HBSS等适当溶液稀释DCFH-DA，使终浓度为10微摩尔/升。去除细胞培养液，加入适当体积稀释好的DCFH-DA。加入的体积以能充分盖住细胞为宜，通常对于六孔板的一个孔加入稀释好的DCFH-DA不少于1毫升。37ºC细胞培养箱内孵育20分钟。用细胞外液(C0216)或酌情使用PBS、HBSS、无血清细胞培养液等适当溶液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。通常活性氧阳性对照在刺激细胞20-30分钟后可以显著提高活性氧水平。
收集细胞后装载探针：按照1:1000用细胞外液(C0216)或酌情使用PBS、HBSS等适当溶液稀释DCFH-DA，使终浓度为10微摩尔/升。细胞收集后悬浮于稀释好的DCFH-DA中，细胞浓度为一百万至二千万/毫升，37ºC细胞培养箱内孵育20分钟。每隔3-5分钟颠倒混匀一下，使探针和细胞充分接触。用细胞外液(C0216)或酌情使用PBS、HBSS、无血清细胞培养液等适当溶液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。直接用活性氧阳性对照或自己感兴趣的药物刺激细胞，或把细胞等分成若干份后刺激细胞。通常活性氧阳性对照在刺激细胞20-30分钟后可以显著提高活性氧水平。
说明：仅在阳性对照孔中加入Rosup作为阳性对照，其余孔不必加入Rosup。细胞外液推荐使用细胞外液(Extracellular Solution) (C0216)，PBS推荐使用PBS (C0221A)，HBSS推荐使用Hanks' Balanced Salt Solution (C0218)。
2. 检测
对于原位装载探针的样品可以用激光共聚焦显微镜直接观察，或收集细胞后用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测。对于收集细胞后装载探针的样品可以用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测，用激光共聚焦显微镜直接观察也可以。
3. 参数设置
使用488nm激发波长，525nm发射波长，实时或逐时间点检测刺激前后荧光的强弱。DCF的荧光光谱和FITC非常相似，可以用FITC的参数设置检测DCF。DCF的激发光谱和发射光谱参考下图。

4. 其它说明
阳性对照Rosup可以按照1:1000的比例酌情使用PBS、HBSS、细胞外液或无血清培养液稀释后使用。例如装载好探针的细胞，直接吸除液体或离心后吸除液体，加入适当体积的按照1:1000稀释的Rosup阳性对照刺激。通常刺激后20-30分钟内可以观察到非常显著的活性氧水平升高。对于不同的细胞，活性氧阳性对照的效果可能有较大的差别。如果在刺激后30分钟内观察不到活性氧的升高，可以适当提高活性氧阳性对照的浓度。如果活性氧升高得过快，可以适当降低活性氧阳性对照的浓度。Rosup对不同细胞的效果会有所不同。
另外，对于某些细胞，如果发现没有刺激的阴性对照细胞荧光也比较强，可以按照1:2000-1:5000稀释DCFH-DA，使装载探针时DCFH-DA的浓度为2-5微摩尔/升。
探针装载的时间也可以根据情况在15-60分钟内适当进行调整。
活性氧阳性对照(Rosup)仅仅用于作为阳性对照的样品，并不是在每个样品中都需加入活性氧阳性对照。

五、碧云天代理——天津益元利康生物科技有限公司

碧云天代理——天津益元利康科技有限公司代理提供碧云天品牌试剂盒、细胞相关产品、蛋白、等产品系列，欢迎咨询！

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