食品和饲料样品的水解-化工仪器网-手机版

3.1 简介

食品和饲料由包含生长和营养所必需氨基酸的化合物组成。分析氨基酸含量对于确保合适的营养非常重要。但是，这些产品是通过批量工艺生产的。与药物生产一样，批量工艺在生产运行过程中，产出可能会有所不同。因此，必须考虑代表性样品的构成因素。通常需要采用二次抽样策略。这些产品的氨基酸分析需要采用多种方法，以便正确分析样品的总蛋白质组成。由于食品和饲料是批量生产的，且其中包含非蛋白质成分，因此建议使用液相水解方法。

注：含硫氨基酸 - 半胱氨酸和蛋氨酸，以及色氨酸在标准酸水解中不稳定。可以采用替代方法来有效分析这些氨基酸。

本节介绍了三种不同的水解方法：

酸水解 - 测定总蛋白质含量和组成
过甲酸氧化 - 测量含硫氨基酸 - 半胱氨酸和蛋氨酸
碱水解 - 评估色氨酸回收率

3.2 食品和饲料的酸水解

分析结合在蛋白质中的氨基酸时，必须破坏肽键，释放氨基酸以进行分析（图1）。对于要水解的饲料蛋白质样品，应考虑样品材料的pH值和存在的固体。如之前的小节所述，水解的速率或程度因蛋白质中存在的氨基酸而异。对于食品材料中结合的蛋白质而言尤其如此。和其他水解方法一样，选择参数的必须基于严谨实验的结果。

在饲料分析中，必须牢记样品制备的三个因素：

样品处理
水解的样品量
用于水解的酸体积

3.2.1 样品处理

饲料谷物及类似的样品通常不均匀。为了使这类样品尽可能地保持均匀，应将样品研磨成细粉。对于高脂样品，可以在最终研磨前通过标准程序进行脱脂处理。细粉可有效水解饲料蛋白质。AOAC方法（4.1.11，994.12b，J.AOAC Int.88，2005，饲料的氨基酸分析）中要求将测试样品研磨至能够通过0.25 mm或60目筛（粒径250 µm）的程度。

3.2.2 样品量

对于饲料的氨基酸分析，AOAC方法建议使用以下计算来确定饲料分析中使用的样品量。

要计算要使用的待测样品的大致量，公式如下：

Ws = 1000/Ns

其中，Ns = 待测样品的氮含量(%)，Ws = 与10 mg氮含量相当的待测材料的重量(mg)。

一般来说，对于每个分析的样品，所用材料的含量范围约在100–1000 mg内。

3.2.3 酸体积

如前所述，有效水解蛋白质样品需要大量过量的酸。饲料也不例外。但是，与第2.1.2节中讨论的过量100倍不同，根据AOAC方法994.12中的说明，添加的酸重量与样品重量的比率范围应为50–500倍。由于该范围较大，以及饲料中存在大量非蛋白质颗粒物质，因此要先对范围进行仔细地探索研究，然后才能将范围应用于常规饲料分析。

3.2.4 内标

使用内标(IS)可很好地补偿样品中各氨基酸可能发生的水解。沃特世建议在UPLC上使用正缬氨酸(Nva)作为AccQ•Tag Ultra的内标，在HPLC上使用α-氨基丁酸(AABA)或正亮氨酸作为AccQ•Tag的内标。AOAC方法994.12中推荐使用正亮氨酸作为饲料分析的内标。请谨慎选择内标，确保色谱中氨基酸峰之间可以获得所需的分离度。

3.2.5 AOAC 994.12 - 饲料中的氨基酸

文献报道了多种适用于饲料中氨基酸分析的方法。此处介绍的方法改编自AOAC方法994.12“饲料中的氨基酸”。

3.2.5.1 设备和玻璃器皿：

分析天平（可读性：± 0.1 mg）
上皿式天平
溶剂瓶，50 mL；聚乙烯
可使用水解试管、烧瓶
可使用消解器、加热罩或水浴
过滤器装置，0.22 µm（Millex GS、Millipore均适用）
pH计，经pH 2.0、4.0和7.0的缓冲液校正
回流冷凝器
旋转蒸发仪
玻璃烧杯（250 mL和1000 mL）
锥形瓶(150 mL)
圆底蒸发瓶(1000 mL)
量筒（100 mL、500 mL和1000 mL）
容量瓶(1000 mL)
移液管（10 mL和20 mL）
烧结玻璃过滤器（孔隙10–15 µm）
注射器

3.2.5.2 试剂

DL-正亮氨酸（晶体）
浓盐酸
氢氧化钠，30%溶液(30 g/100 mL)
苯酚（晶体）
硫二甘醇（98%溶液）
二水合柠檬酸三钠
pH缓冲液（pH 2.0、4.0和7.0）

3.2.5.3 溶液制备

柠檬酸钠缓冲液 - pH 2.20

称取19.60 g二水合柠檬酸三钠，放入1000 mL烧杯中。
将其溶于约800 mL水中。
搅拌时，加入10 mL 98%硫二甘醇溶液和15 mL HCl。
将溶液定量转移至1000 mL容量瓶中，用水定容。
使用烧结玻璃过滤器过滤缓冲液。
用HCl或2 M NaOH将pH调节至2.20。

6 M HCl-苯酚溶液

称取1 g苯酚晶体，放入已去皮重的1000 mL烧杯中。
将晶体溶于500 mL水中。搅拌时，缓慢加入500 mL HCl。

盐酸溶液 - 1 M

将约800 mL水倒入1000 mL容量瓶中。
使用移液管加入83.3 mL HCl。
用水定容并充分混合。

盐酸溶液 - 0.1 M

将约800 mL水倒入1000 mL容量瓶中。
使用移液管加入100 mL 1 M HCl。
用水定容并充分混合。

氢氧化钠溶液(2 M NaOH)

称取80.0 g NaOH，放入已去皮重的1000 mL烧杯中。
在烧杯中，将颗粒缓慢溶于约600 mL水中。
冷却溶液并将其定量转移至1000 mL容量瓶中。
用水定容并充分混合。

内标溶液

准确称取195–200 mg DL-正亮氨酸晶体，放入已去皮重的150 mL锥形瓶中。
用100 mL 1 M HCl溶解晶体。
将溶液定量转移至1000 mL容量瓶中，用水定容。

3.2.5.4 水解步骤

准确称取100–1000 mg研磨粉碎的待测样品（精确至0.1 mg；相当于氮含量约10 mg），放入带标记的水解试管中。使用之前小节中所述的计算方法确定要使用的实际样品量。
将50 mL 6 M HCl-苯酚溶液加入已称重的样品中，稍稍搅拌。向溶液中加入2–3块沸石。
在通风橱中，使用平衡至110–120 °C温度的加热器或水浴，回流水解24 h。
将水解试管从加热装置中取出，等待试管冷却至室温。
使用移液管，将20 mL正亮氨酸内标溶液加入各待测溶液中。摇动烧瓶，将溶液混合。
使用烧结玻璃过滤器将水解产物过滤到带标记的1000 mL的圆底蒸发瓶中。
将蒸发瓶连接至旋转蒸发仪，在60 °C下蒸干。
加入约20 mL水清洗，然后重复蒸发。重复清洗和蒸发步骤两次。
从蒸发仪中取出蒸发瓶。
将50 mL柠檬酸钠缓冲液加入蒸发后的水解产物中，充分混合，然后转移至带标记的50 mL聚乙烯瓶中。
现在可对样品进行衍生化处理。

3.3 使用过甲酸氧化法测定半胱氨酸、胱氨酸和蛋氨酸

半胱氨酸和蛋氨酸是饲料材料分析中的关键氨基酸；两者都可限制食用饲料动物的生长。由于标准酸水解条件不适用于这两种特定氨基酸，因此通常替代使用过甲酸进行氧化。该方法可将半胱氨酸和胱氨酸转化为三聚氰酸，将蛋氨酸转化为蛋氨酸砜（图3）。然后可对样品进行有效的酸水解和衍生化处理。

文献中报道了多种形式的过甲酸氧化。尽管总体过程相似，但具体情况有所不同。本指南中介绍了可用作可能起点的两种流程。第一种方法来自AOAC 994.12。第二种方法基于MacDonald等人(1985)的报道，为其方法的替代方法。在选择具体方法之前，必须仔细地评估和优化。

3.3.1 过甲酸氧化，方法1，AOAC 994.12

3.3.1.1 设备和玻璃器皿

分析天平（可读性：± 0.1 mg）
上皿式天平
溶剂瓶，50 mL；聚乙烯
可使用水解试管、烧瓶
可使用消解器、加热罩或水浴
过滤器装置，0.22 µm（Millex GS、Millipore均适用）
pH计，经pH 2.0、4.0和7.0的缓冲液校正
回流冷凝器
旋转蒸发仪
玻璃烧杯（250 mL和1000 mL）
锥形瓶(150 mL)
圆底蒸发瓶(1000 mL)
量筒（100 mL、500 mL和1000 mL）
容量瓶(1000 mL)
移液管（10 mL和20 mL）
烧结玻璃过滤器（孔隙10–15 µm）
冰浴
注射器

3.3.1.2 试剂

甲酸(88%)
过氧化氢(30%)
焦亚硫酸钠
DL-正亮氨酸（晶体）
浓盐酸
氢氧化钠，30%溶液(30 g/100 mL)
苯酚（晶体）
硫二甘醇（98%溶液）
二水合柠檬酸三钠
pH缓冲液（pH 2.0、4.0和7.0）

3.3.1.3 溶液制备

柠檬酸钠缓冲液 - pH 2.20

称取19.60 g二水合柠檬酸三钠，放入1000 mL烧杯中。
将其溶于约800 mL水中。
搅拌时，加入10 mL 98%硫二甘醇溶液和15 mL HCl。
将溶液定量转移至1000 mL容量瓶中，用水定容。
使用烧结玻璃过滤器过滤缓冲液。
用HCl或2 M NaOH将pH调节至2.20。

6 M HCl-苯酚溶液

称取1 g苯酚晶体，放入已去皮重的1000 mL烧杯中。
将晶体溶于500 mL水中。搅拌时，缓慢加入500 mL HCl。

盐酸溶液 - 1 M

将约800 mL的水倒入1000 mL容量瓶中。
使用移液管加入83.3 mL HCl。
用水定容并充分混合。

盐酸溶液 - 0.1 M

将约800 mL的水倒入1000 mL容量瓶中。
使用移液管加入100 mL 1 M HCl。
用水定容并充分混合。

氢氧化钠溶液(2 M NaOH)

称取80.0 g NaOH，放入已去皮重的1000 mL烧杯中。
在烧杯中，将颗粒缓慢溶于约600 mL水中。
冷却溶液并将其定量转移至1000 mL容量瓶中。
用水定容并充分混合。

内标溶液

准确称取195–200 mg DL-正亮氨酸晶体，放入已去皮重的150 mL锥形瓶中。
用100 mL 1 M HCl溶解晶体。将溶液定量转移至1000 mL容量瓶中，用水定容。

过甲酸试剂

在通风橱中制备。称取25 mg苯酚晶体，放入25 mL试管中。
使用微量移液管加入0.5 mL 30% 过氧化氢。
加入4.5 mL 88%甲酸溶液。
用塞子塞紧试管，在室温下等待混合物静置30 min。
30 min后，将试管置于冰浴中，等待过甲酸混合物冷却15 min。
请在临使用前制备试剂。

3.3.1.4 过甲酸氧化

准确称取100–1000 mg研磨粉碎的待测样品（精确至0.1 mg；相当于氮含量约10 mg），放入带标记的水解试管中。使用上述计算方法确定要使用的实际样品量。
将磁力搅拌器放入各试管中，并将水解试管置于冰浴(0 °C)中。
等待过甲酸和待测样品冷却至少15 min后，向每个水解试管中加入5 mL过甲酸试剂；塞紧所有试管或盖上盖子，搅拌15 min。
将水解试管放回冰浴中，等待样品氧化16 h。
取下玻璃塞，加入约0.84 g焦亚硫酸钠以分解过甲酸。搅拌15 min，释放SO₂。
现在样品可进入酸水解阶段。

3.3.1.5 水解步骤

将50 mL 6 N HCl-苯酚溶液加入已称重的样品中，稍稍搅拌。向溶液中加入2–3块沸石。
在通风橱中，使用平衡至110–120 °C温度的加热器或水浴，回流水解24 h。
将水解试管从加热装置中取出，等待试管冷却至室温。
使用移液管，将20 mL正亮氨酸内标溶液加入各待测溶液中。摇动烧瓶，将溶液混合。
继续下面的步骤(a-d)或(e-g)。

使用烧结玻璃过滤器将水解产物过滤到带标记的1000 mL圆底蒸发瓶中。
将蒸发瓶连接至旋转蒸发仪，并在40 °C真空条件下蒸发至0.5 mL，注：请勿将溶液蒸干。
从蒸发仪中取出蒸发瓶。
将50 mL柠檬酸钠缓冲液加入蒸发后的水解产物中，充分混合，然后转移至带标记的50 mL聚乙烯瓶中。
使用烧结玻璃过滤器将水解产物过滤到250 mL真空烧瓶中，然后将滤液转移到250 mL烧杯中。
将烧杯置于冰浴中。
在搅拌的同时，使用约40 mL 7.5 M NaOH部分中和水解产物。（注：温度不得超过40 °C。）使用2 M NaOH将pH调节至2.20。

6.现在可对样品进行衍生化处理。

3.3.2 基于MacDonald等人(1985)报道的方法，进行胱氨酸和蛋氨酸的过甲酸氧化和酸水解（方法2）

注：文献中报道了许多有关该分析的不同参考资料，其中关于过甲酸和溴化氢的含量或蒸发温度未达成一致。更改含量和/或温度将影响步骤7中的蒸发时间。

3.3.2.1 材料

25 × 150 mm带盖试管
冰和冰浴
移液管
真空蒸发仪
洁净的氮气源
恒温箱或加热器
玻璃量具
过甲酸
过氧化氢
甲酸
超纯水
HBr溶液，48%（重量比）

3.3.2.2 过甲酸试剂

将1体积的30%过氧化氢加入9体积的88%甲酸中。
将混合物静置1 h，频繁摇动。
将混合物置于冰浴中30 min，然后立即使用。

3.3.2.3 步骤

称取相当于约20 mg蛋白质（精确至mg）的样品，放入25 × 150 mm试管中。
将样品置于冰浴中30 min。
向样品中加入10 mL冷过甲酸，轻轻摇动，然后使用Teflon垫片盖密封。
将样品（仍处于大量冰中）置于冰箱中(0 °C)冷藏过夜(16 h)。
16 h后，将样品仍保存在0 °C条件下，加入3滴辛醇，然后加入3 mL冷却的48% HBr，缓慢摇动样品。请在通风橱中完成该步骤。将样品在0 °C下静置30 min。
使用真空蒸发仪在37 °C下将样品蒸干。该过程需要1–2 h。
向试管中加入5 mL的6 N HCl。使用氮气吹扫30 s，然后立即封盖。
将样品置于110 °C恒温箱中加热24 h。
将样品从恒温箱中取出，等待样品冷却。
加入10 mL工作内标(5.0 µmol/mL)，并充分混匀。注：应计算所用内标的实际浓度，以使进样至仪器的样品量相同。
将样品定量转移至250 mL容量瓶中，用HPLC级水冲洗样品试管，并用冲洗液定容。
使用0.45 µm样品过滤器过滤步骤12中的样品约1 mL。如果没有立即进行衍生化处理，请将加盖的样品储存于冰箱中。注：离心可代替该过滤步骤。离心以产生澄清的上清液。