样品制备不当是否正在影响您的生物分析方法?

引言

样品制备在使用色谱法进行生物分析中至关重要。如果不进行任何样品制备步骤，例如蛋白沉淀、磷脂去除 (PLR)、液液萃取 (LLE) 或固相萃取 (SPE)，系统性能将受到负面影响。常见的问题包括高效液相色谱 (HPLC) 管路堵塞、色谱柱污染、质谱仪源污染以及灵敏度下降。

样品制备方法的清洁性能各不相同，其中蛋白沉淀是用于色谱分析生物样品（如血浆或血清）流行的方法之一。这是一种快速且简单的操作 - 将样品加入溶剂后引发蛋白沉淀，最终通过过滤器过滤液体，获得无蛋白的样品。

尽管蛋白沉淀可以去除蛋白，但它无法去除其他基质成分，例如磷脂。这些基质成分在进行 LC-MS/MS 分析时会引发以下问题：

1. 磷脂会影响质谱仪源中的离子化，通常表现为离子抑制，更少见的是离子增强，从而降低分析的稳健性。^[1]

2. 磷脂会污染质谱仪源，导致维护成本增加，同时仪器停机时间也会延长。

3. 磷脂会在 HPLC 柱上积累，随着时间的推移导致柱背压升高并缩短柱的使用寿命。^[2]

样品制备的改进技术

磷脂去除（PLR）是一种用于生物样本分析的样本制备技术。PLR与蛋白沉淀板的操作流程相似，但其产品中加入了一种活性成分，可以捕获磷脂而不保留目标分析物（如图1所示）。因此，PLR为生物样本制备提供了全面的解决方案。

图1 - 用于制备用于LC-MS分析的血浆的简单PLR。

在本应用说明中，比较了两种常用样品制备方法（磷脂去除PLR和蛋白沉淀）在LC-MS/MS 分析中对牛血浆样品的磷脂去除效果和分析物回收率的差异。

用于制备磷脂去除样品的是 Microlute® PLR 板。

Microlute® 系列采用新颖的复合技术（图 2），该技术将捕获磷脂的活性材料与惰性聚乙烯结构相结合。这种设计通过提高样品流入收集板的流动一致性，改善了样品制备的重复性，从而具有显著优势。

图 2 – Microlute® 复合技术的示意图

实 验

血浆样品的制备

将普鲁卡因胺以三种不同浓度（25 ng/mL、250 ng/mL 和 1250 ng/mL）加入牛血浆中。溶液混匀后静置平衡一小时。

校准曲线的制备

取 100 µL 未加标的空白血浆，加入到 Microlute® PLR板的四个孔中，随后加入 300 µL 含 1%甲酸（v/v）的乙腈。每个孔用移液器吸取混匀五次，以确保溶液充分混合并使蛋白质沉淀。通过正压以每秒一滴的流速将沉淀后的溶液洗脱至1.1 mL 收集板（Porvair Sciences 产品代码：219250）中。将处理后的血浆混合液转移至1.5 mL 微量离心管中，并涡旋混匀 10 秒钟。取 100 µL 混合血浆加入六个孔中，制备一个空白标准和五个校准标准。五个校准标准通过添加以下浓度的普鲁卡因胺溶液制备：10、100、200、500和 1,500 ng/mL。

含标血浆的处理

将 100 µL 不同浓度的加标血浆分别加入到 Microlute® PLR 板和蛋白沉淀板（Porvair Sciences 产品代码：240100）的孔中，进行重复实验。每种浓度做两次重复。每孔加入 300 µL 含 1% 甲酸（v/v）的乙腈。用移液器吸取液体五次，以确保溶液充分混合并使蛋白质沉淀。随后通过正压以每秒一滴的流速将沉淀后的溶液洗脱至 1.1 mL 收集板中。

稀释步骤

为改善 LC-MS/MS 方法的峰形及稳定性，将处理后的加标血浆和标准品溶液按 1:10 比例用含 0.1% 甲酸（v/v）的水中稀释。这一稀释步骤可防止由于洗脱液有机强度过高而导致的不良峰形问题。

图 3 – 普鲁卡因胺峰形的叠加比较 – 未稀释（绿色曲线）与 1:10 稀释（橙色曲线）

LC-MS/MS 方法用于柱后注入

以下方法用于筛查蛋白沉淀样品和 Microlute® PLR 样品中常见的磷脂[3]，并通过柱后注入法监测任何基质效应（离子增强/抑制）。注入的溶液是浓度为 100 ng/mL 的普鲁卡因胺溶液，以 10 µL/min 的速率注入流动相 A 中。

HPLC 条件：

质谱仪条件

MRM 过渡

               LPC =溶血磷脂酰胆碱,   PC = 磷脂酰胆碱,  SM = 神经酰胺

用于普鲁卡因胺的LC-MS/MS方法

为分析加标样品和校准曲线，采用了以下LC-MS/MS方法：

质谱仪条件

结果与讨论

磷脂去除效果

为分析通过蛋白质沉淀和复合PLR技术（Microlute® PLR）制备的血浆样本中是否仍然存在磷脂？采用MRM LC-MS/MS方法扫描血浆中的常见磷脂，比较蛋白沉淀法和复合PLR技术（Microlute® PLR）的样品处理效果。

磷脂去除PLR板处理的样品在色谱图中几乎没有磷脂信号，仅有基线噪音，表明样本中所有干扰分析的磷脂已全被去除（图4）。而蛋白沉淀样本则显示较大峰面积，表明磷脂仍然残存于样本中。

       图 4 – 每个样本中磷脂质MRM的重叠轨迹        A=蛋白质沉淀样本   B = 磷脂去除板

图 5 – 使用Microlute® PLR板和蛋白沉淀板处理样品中的总磷脂峰面积的对比。Microlute® PLR板处理样品的总峰面积=5.47 x 104，而蛋白沉淀板处理样品的总峰面积=1.42 x 108

通过对磷脂色谱图（图4）的总峰面积进行比较，结果以柱状图形式呈现（图5）。Microlute® PLR板处理的样品中磷脂响应很低 (5.47 x 104) ，而蛋白沉淀板处理的样品则显示非常大的总峰面积 (1.42 x 108).

基质效应 - 离子抑制

为了量化磷脂对电离的影响，进行了普鲁卡因胺的柱后注入实验，同时注入分别采用蛋白沉淀板和Microlute® PLR板制备的空白样品。

磷脂去除板（蓝色曲线）显示，与注入空白溶液（绿色曲线）相比，整个运行过程中离子化未受到影响。然而，蛋白沉淀样品（黑色曲线）由于磷脂的离子抑制作用，在1.5分钟至2.5分钟之间的基线出现下降。如图6所示，在磷脂共同洗脱的区域（红色曲线），信号显著降低。观察到的大的信号下降约为75%，出现在普鲁卡因胺的保留时间约为2分钟。

图6 - 普鲁卡因胺注入溶剂空白样品（绿色）、Microlute® PLR处理的样品（蓝色）以及蛋白质沉淀样品（黑色）的注入痕迹叠加图。同时叠加显示了蛋白沉淀样品的磷脂痕迹（红色）。

普鲁卡因胺标准曲线

制备基质匹配标准品，以演示使用Microlute® PLR创建的校准曲线（图7）。标定曲线呈线性，相关系数（r²）为0.9995。本研究表明，普鲁卡因胺的校准范围为10 ng/mL至1500 ng/mL，并且呈线性关系。

图7 – 基质匹配标准校准曲线，范围从10 – 1500 ng/mL，r²值 = 0.9995。

普鲁卡因胺的制备比较——蛋白沉淀法与PLR法

为模拟生物分析方法中使用的质量控制（QC）样品，制备了三种不同浓度的血浆样品- 低QC（25 µg/mL）、中QC（250 µg/mL）和高QC（1,250 µg/mL），每种浓度均进行了两次重复，分别采用蛋白沉淀法和Microlute® PLR板进行制备。

使用LC-MS/MS对这些样品进行分析，并通过比较峰面积来量化差异的百分比。在很低且很具挑战性的浓度下，两种制备方法的峰面积差异为9.6%（见表1）。这表明，两种制备方法在从血浆中回收普鲁卡因胺方面同样有效。

           表1 – 使用三种不同浓度水平的血浆制备普鲁卡因胺的峰面积（每种浓度进行两次重复）。两种技术在各浓度下的峰面积百分比差异。

结 论

本研究简要展示了在生物样品的色谱分析前进行样品制备的必要性。样品制备可以避免离子抑制，从而提高信号强度和灵敏度，同时减少仪器维护需求。此外，通过比较两种技术（蛋白沉淀法和PLR法），结果表明磷脂去除活性成分并未影响分析物的回收率。这说明Microlute® PLR板具有更优异的性能，不仅保持了高回收率，同时减少离子抑制，从而提供更可靠和稳健的分析结果。

参考文献：

1: O. A. Ismaiel, M. S. Halquist, M. Y. Elmamly, A. Shalaby and H. T. Karnes, “Monitoring phospholipidsfor assessment ofion enhancement and ionsuppression in ESI andAPCI LC/MS/MSfor

chlorpheniramine in human plasma andthe importance of multiplesource matrix effect evaluations,”Journal ofChromatography B,vol. 875, no. 2, pp. 333-343, 2008.

2:J. CarmicalandS. Brown, “The impact of phospholipidsand phospholipid removal on bioanalyticalmethod performance,” Biomedical Chromatography,vol. 30, no. 5, pp. 710-720, 2016.

3: G. B. PhillipsandJ.T. Dodge, “Composition of phospholipids and of phospholipidfattyacids ofhuman plasma,”Journal of Lipid Research,vol. 8, no. 6, pp. 676-681, 1967.