TaqMan One Step RT-qPCR Kit

TaqMan One Step RT-qPCR Kit

产品货号：T11239

产品规格：50T/200T

产品介绍:

TaqMan One Step RT-qPCR kit （qRT-PCR Probe）是一步法（One Step）RT-PCR荧光定量探针法定性、定量反应的专用试剂，反应过程在同一管内连续进行，避免开管，能有效防止污染。本品含有高温反转录酶（RNase H-）和新型热启动酶，具有更高的反转录和PCR扩增效率，适合于低浓度RNA模板的高灵敏度扩增。本试剂采用优化配方的专用Buffer，可以在较宽的定量区域内得到良好的标准曲线，准确进行定量，并与多数厂家的荧光定量PCR 仪兼容，如Applied Biosystems、 Eppendorf、Bio-Rad和Roche等。

试剂组成：

25×One Step RT-qPCR RTase mix

5×One Step RT-qPCR Buffer

10×Enhancer

试剂原理： 

TaqMan One Step RT-qPCR kit首先利用反转录酶RTase将RNA反转录成cDNA，再以cDNA为模板通过热启动DNA扩增酶在单管闭管反应体系中连续进行PCR扩增反应，利用荧光标记探针（Probe）水解发光，并对发光信号进行检测。

1. RT-PCR

首先采用反转录酶以RNA为模板合成cDNA，然后再以合成的cDNA为模板，经过PCR扩增反应的热变性、引物退火、链延伸三个步骤循环往复，在短时间内扩增得到大量DNA片段。

2. 荧光检出

TaqMan探针法是使用5’端带有荧光物质，3’端带有淬灭物质的TaqMan探针进行荧光检测的方法。在探针没有被 Taq酶分解时，5’端的荧光物质受到3’端淬灭物质的制约，不能发出荧光。而当TaqMan探针被分解后，5’端的荧光物质便会游离出来，发出荧光。在PCR反应液中加入荧光探针后的退火过程中，荧光探针便会和模板配对区域结合。在PCR反应的延伸过程中，Taq DNA聚合酶的5’→3’ 核酸外切酶活性可以分解和模板杂交的荧光探针，游离出的荧光物质便会发出荧光。通过检测反应体系中的荧光强度，可以达到检测PCR产物扩增量的目的。

反应条件： 

1. PCR 程序（两步法）

反转录：50℃ 20分钟；

变  性：95℃ 3分钟；

变  性：95℃ 10~20秒；

退火/延伸：60℃ 20~60秒

2. PCR 程序（三步法）

反转录：50℃ 20分钟；

变  性：95℃ 3分钟；

变  性：95℃ 10~20秒；

退  火：56-64℃ 10~30秒；

延  伸：72℃ 10~60秒。

RT-PCR 反应体系配制

1. 通常引物终浓度为0.2µM可以得到较好结果。反应性能较差时，可以在0.1～1.0µM范围内调整引物浓度；

2. 通常探针浓度可在0.1～0.3µM范围内优化。可进行浓度梯度的实验，寻找引物和探针的最佳组合。探针的使用与 Real Time PCR扩增仪、探针种类、荧光标记物质种类有关，请参照仪器说明书或各荧光探针的具体使用要求进行；

3. 不同种类的模板中含有的靶基因的拷贝数不同，必要时可进行梯度稀释，确定最佳的模板添加量。

质量控制： 

1. 功能检测：qPCR的敏感性、特异性、可重复性；

2. 无外源核酸酶活性，无外源内切、外切核酸酶污染。

技术说明： 

1. 该体系常用50℃进行反转录反应，可以在45℃~60℃范围内进行反转录温度优化；根据反应特征不同，可以在5~30分钟内对反转录时间进行优化；

2. 该体系所用的反转录酶是在MMLV基础上进行了基因改造，去除了RNaseH活性，使其具有更高的温度耐受性和反转录温度，对RNA复杂结构模板具有更高的反转录效率；

3. 该体系具有更好的体系稳定性和适用性，非常适合于病毒类、组织提取RNA复杂模板的检测；对极限浓度模板的扩增效果更加稳定。

保存：

-20℃保存长期保存，使用前应混匀，避免反复冻融。