NGS方法已被广泛用于检测大多数序列变异。然而，这些方法无法准确解析基因组中复杂的重复或高GC含量区域。这使得结构变异的检测尤其具有挑战性。利用Bionano 光学基因组图谱技术 (Optical genome mapping,OGM)，可以在高灵敏度下以无偏、全基因组的方式检测结构变体。这项革命性的技术揭示了传统测序和细胞遗传学分析之前的“盲点”；然而，它需要分离超高分子量（UHMW）DNA。超长分子的长度通常在250 kbp以上甚至超过1 Mbp，传统的提取方法很难完整获取。为了应对这一技术挑战，Hamilton与Bionano Genomics合作开发了提供超高分子量DNA提取的自动化解决方案-Long String VANTAGE. 这使得基因组DNA提取过程中大大减少了碎片的产生。从这一自动化过程中提取的超高分子量DNA进而被标记，并为光学基因组作图（OGM）分析生成高质量数据。
在不断发展的基因组研究领域，技术创新为深入了解以前尚未解决的基因组生物学问题提供了机会。超长DNA分子的绘图改变了我们看待基因组的方式，对其结构的分辨率达到了很高的水平。Hamilton提供超高分子量DNA提取的自动化解决方案-Long String Vantage. 利用这种高效、省时的样本处理解决方案，可以更高通量的实现光学基因组作图（OGM）。
方法描述
该方法基于 Bionano Prep SP 冷冻细胞沉淀 DNA 提取方法，并对自动化过程进行了优化。简言之，将约100万个细胞的冷冻 HL-60 细胞沉淀手动重悬于含有 RNase A 的 DNA 稳定缓冲液中，并放置在96深孔板中。后续步骤将在Long String VANTAGE 仪器上自动化执行。
细胞裂解和蛋白酶 K消化将在特制缓冲液中进行。随后通过加入 PMSF 终止该过程。通过加入异丙醇将 UHMW DNA 结合到 Bionano Prep SP Disk上。随后进行3个洗涤步骤，从结合的DNA中去除杂质。对于最终洗脱，将Disk转移至微孔板顶部的预填充洗脱缓冲液条中。
最后，用户可以在台面外进行离心步骤，将最终洗脱液留在微孔板中，将Disk保留在 Hamilton 洗脱条中。该过程获得了适用于 Bionano Genomics 下游直接标记和染色 (DLS) 过程的 UHMW DNA 提取物。该过程基于酶法进行基因组特异性标记，最终可在Bionano Genomics Saphyr ®系统上收集数据。
系统描述
Long String VANTAGE 是一种即用型工作站，具有标准化硬件配置，适用于自动化magnetic disk或磁珠处理工作流程。本品仅适用于研究用途 (RUO)。其基于Microlab ®VANTAGE平台，具有4个1 mL CO-RE ®移液通道以及4个用于disk处理步骤的5 mL CO-RE®通道。
应用软件
Long String VANTAGE VENUS框架是专门为该方法而设计和开发的。
试剂盒描述
Bionano 的 SP 血液和细胞培养 DNA 分离试剂盒 (80042) 是在Long String VANTAGE 上开发UHMW DNA 提取自动化工作流程的基础。该方法通过简单的裂解、结合、洗涤和洗脱流程来获得UHMW DNA。该试剂盒使用的是由纳米结构二氧化硅表面覆盖的顺磁盘，而不是磁珠或硅基离心柱。这提供了高 DNA 结合能力，并有助于保护结合的 DNA 免受剪切力破坏。回收的 UHMW DNA 大小通常在 250 kbp 至 > 1 Mbp之间，浓度范围为50-120 ng/µL。
可视化流程
使用人白血病细胞系HL-60细胞沉淀测试自动化方案。
HL-60细胞（DMSZ，ACC3）在DMEM+10%FBS和双抗培养基中于37°C，含5%CO2的潮湿环境中培养。通过离心收集细胞，并在使用前作为1.5 M HL-6细胞的细胞沉淀在-80°C下冷冻存储。在实验当天，将细胞沉淀在37°C下解冻30秒，并通过手动移液将其重悬于40μL DSB/RNase Cocktail混合液中。将得到的细胞悬浮液合并，将对应于100万个细胞的体积转移到96深孔板的单个孔中，并提供给Long String VANTAGE。在对层叠在洗脱板顶部的条带进行裂解和消化、结合、洗涤和Disk转移后，在室温下以2200 rcf对洗脱板组件进行离心1分钟。
该方法成功的得到验证，每次可处理12个样品。使用相同参数共进行了4次验证试验（3次试验，4个样品，1次试验，12个样品）。
在Long String VANTAGE上洗脱UHMW DNA后，使用标准200μL吸头将样品剪切4次，然后在Hula混合器上进行1小时颠倒混匀，并在室温下孵育过夜。根据说明书，使用Qubit dsDNA BR检测试剂盒对UHMW DNA进行定量。然后使用Bionano Prep直接标记和染色（DLS）方案的优化版本标记DNA。根据系统用户指南，使用Qubit 1X dsDNA HS检测试剂盒对标记的DNA进行定量，并将其加载到Bionano芯片上，在Saphyr仪器上运行。收集所有样品大于150kbp分子的400Gbp光学数据。
技术
Hamilton专有的磁棒技术确保了最佳的Magnetic Disk处理。Paramagnetic Disk可通过5ml移液通道直接操作，无需额外的台面设备。可调参数设置确保最佳实验结果。
Hamilton Magrod套筒以最高的精度制造，并根据可能的最佳Magnetic Disk定位进行塑形。匹配可保护Magrod免受周围液体和试剂的影响。Hamilton洗脱条用于通过离心从最终UHMW DNA样品中分离Magnetic Disk。Disk保留在条带中，而洗脱液被吸入微量滴定板。
结果
自动化过程获得的结果表明，样品产率是可重复的，并符合Bionano Prep SP冷冻细胞沉淀DNA分离方案（图A，蓝条）中规定的手动提取的预期值。
DLS标记后进行额外的样品浓度测量，以确保有足够的产量用于进一步处理（图A，灰点）。数据表明，对于在Long String VANTAGE上分离的所有样品，都回收和体现了合适量的产物DNA。
在Saphyr仪器上运行的样本数据分析表明，分子长度超过了Bionano Genomics提供的阈值，并证明存在大于230 kbp的超高分子量DNA（图B）。从Hamilton Long String VANTAGE分离的DNA包含Mbp长度的分子，在提取、标记、线性化和成像后，其总体上超过了230 kbp的OGM质量阈值。
从Saphyr仪器收集的数据中得出了进一步的质量控制指标（下图）。所有样本在特异性和灵敏度范围内均显示出一致的标记性能（下图A、B）。Map率超过了Bionano Genomics提供的质量指标阈值（下图C）。
Long String VANTAGE可在一个工作日（8小时）内处理多达12个样品。这比手动方法的效率显著增加，建议每次运行6个样本。
结论
作为精密自动化液体处理的专家和对基因组工作流程的关注，Hamilton正在进入这个应用领域。我们与Bionano Genomics合作，建立了超高分子量DNA提取自动化解决方案。结合光学基因组作图，Long String VANTAGE将能够以从样本中标准化且可重复地提取超高分子量DNA，赋能您的基因研究。
