南京锦维生物工程有限公司 >> 进入商铺
2025/1/2 14:37:16一、毕赤酵母表达系统简介
毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统作为一种高效的真核表达系统,毕赤酵母表达系统具有广泛的应用领域和显著的优势。与其他表达系统相比,毕赤酵母表达系统的优势明显。它拥有目前强、调控机理严格的启动子之一 —— 醇氧化酶基因 AOX1 启动子,这使得外源基因的表达调控更加精准高效。其表达水平高,既能实现胞内表达,又可进行分泌型表达,极大地满足了不同研究和生产的需求。发酵工艺成熟且易于放大,已经具备大规模工业化高密度生产的能力,为产业化发展提供了便利条件。培养成本低,产物易分离,所用发酵培养基廉价,且不含蛋白,有利于下游产品的分离纯化,降低了生产成本。外源蛋白基因遗传稳定,整合到毕赤酵母染色体上后,能随染色体复制而稳定存在,不易丢失。此外,作为真核表达系统,毕赤酵母还具有真核生物的亚细胞结构,能够对表达的蛋白进行糖基化、脂肪酰化、蛋白磷酸化等翻译后修饰加工,使表达出的蛋白在结构和功能上更接近天然蛋白,具有更高的生物活性。
二、毕赤酵母表达系统构成
1、宿主菌
目前用于外源蛋白表达的毕赤酵母宿主菌有: Mut+甲醇利用型GS115、X-33、SMD1165、SMD1163及 SMD1168等大多宿主菌;MutS甲醇利用缓慢型KM71; Mut-甲醇不利用型MC100-3。详见下表,详细地列举了毕赤酵母不同的表达宿主菌及表达特点
表 1常见的毕赤酵母表达宿主菌及特点
菌株 | 特点 |
GS115 | 具有高表达水平、高细胞密度、高可溶性蛋白产量,目前应用广的宿主菌 |
KM71 | 甲醇利用缓慢型,适用于表达难以溶解的蛋白质 |
X33 | 可使表达量和活性提高,适用于表达重组蛋白质 |
SMD1168H | 更好的表达效率和更高的细胞密度,适用于表达大分子蛋白质 |
SMD116(his4 pep4) | 属于蛋白酶缺失型菌株,能够减少蛋白降解,解决由于蛋白降解而引起的表达产物分布不均的问题,不过该菌株生长相对缓慢,可能导致表达的外源蛋白质产量较低。 |
Y-11430 | 高效的表达能力并且具有可调控的表达 |
2、载体
毕赤酵母表达载体以整合型载体为主,常见载体可分为胞内表达载体和分泌表达载体。
表 2 常见的毕赤酵母表达宿载体及特点
胞内表达载体 | 特点 |
基于 AOX1 启动子的胞内表达载体,可以进行高水平的胞内表达 | |
pPIC3K | 基于 AOX1 启动子的胞内表达载体,可以在毕赤酵母中表达目的蛋白, 并带有 kanamycin 抗性标记 |
pGAPZ | 基于 GAPDH 启动子的胞内表达载体,适用于表达中等至高水平的目 的蛋白质,并可进行分泌或胞内表达 |
pGAPZα | 与 pGAPZ 类似,但带有 α 因子信号序列,可提高表达蛋白质的稳定 性和产量 |
胞外表达载体 | 特点 |
pPICZαA/B/C | 基于 AOX1 启动子的胞外表达载体,可以在毕赤酵母中表达目的蛋白, 并具有 α 因子信号序列,可进行高效的分泌表达 |
pPIC9K | 基于 AOX1 启动子的胞外表达载体,可用于高水平的胞外表达,并带 有 G418 抗性标记 |
pPIC3.5K-BGH | 基于 AOX1 启动子的胞外表达载体,带有 β 半乳糖苷酶信号序列,可 用于检测融合蛋白的表达和分泌 |
pYAM75P | 含有多个限制酶切点,方便进行重组操作 |
三、毕赤酵母发酵工艺
1、毕赤酵母发酵阶段
毕赤酵母的发酵一般分两个阶段:1、细胞增长阶段:首先在碳源为甘油或葡萄糖的培养基中进行的生长阶段,积累足够的细胞密度和生物量,在菌体浓度达到一定阶段时,当甘油或葡萄糖耗尽时,会导致溶解氧值突然上升至100%左右,然后开始流加甘油或葡萄糖溶液,并保持通风量和搅拌速度,以维持溶解氧水平在30%左右,进一步增长生物量(菌浓)。2、诱导阶段:当生物量达到要求后,停止补碳源,碳源耗尽,过渡期结束后,将碳源切换至甲醇进行诱导表达目标蛋白的发酵阶段。一般间歇加入0.3%甲醇两次诱导,然后开始流甲甲醇诱导表达蛋白,这种方式可以提高外源蛋白的表达水平,并且使得毕赤酵母在较短时间内积累高浓度的目标蛋白。
诱导表达阶段是毕赤酵母发酵生产过程中的关键环节,在此阶段,甲醇被用作特异性诱导剂,替代先前的碳源。毕赤酵母中的醇氧化酶基因(如 AOX1)在甲醇存在下被激活,从而驱动外源基因的高效表达。该阶段的条件控制对于外源蛋白的产量和质量具有重要影响,需要严格控制甲醇的添加量、添加速率以及发酵环境的温度、pH 值和溶氧量等参数,以确保外源基因能够持续、高效地表达,同时避免甲醇对细胞产生毒性以及其他不利影响。
2、发酵培养基的种类和配方
毕赤酵母发酵培养基的种类多样,不同的培养基配方适用于不同的发酵阶段和目的。
BSM(基础盐)培养基是毕赤酵母发酵常用的基础培养基之一,其典型配方为:85%磷酸 26.7ml/l,二水硫酸钙 0.93g/l,硫酸钾 18.2g/l,七水硫酸镁 14.9g/l,氢氧化钾 4.13g/l,甘油 40.0g/l,PTM1 4.35ml/l。这种培养基能够为毕赤酵母的生长提供基本的营养成分,包括氮源、磷源、钾源、镁源等无机盐以及甘油作为碳源,PTM1 则补充了酵母生长所需的微量元素和维生素等营养物质,有助于维持酵母细胞的正常生长和代谢。
F22 培养基也是一种常见的毕赤酵母发酵培养基,其配方在不同的研究和生产应用中可能会有所调整,但一般包含适量的碳源(如葡萄糖或甘油)、氮源(如酵母提取物、蛋白胨等)、无机盐(如硫酸镁、氯化钙、磷酸二氢钾等)以及其他添加剂(如生物素、微量元素溶液等)。与 BSM 培养基相比,F22 培养基在营养成分的组成和比例上可能有所优化,以满足特定的发酵需求,例如在某些情况下可能更有利于提高外源蛋白的表达量或改善蛋白的质量。
除了上述两种常见的培养基外,还有许多其他的毕赤酵母发酵培养基,这些培养基的配方往往是根据具体的实验目的、菌株特性以及发酵工艺的要求进行优化和调整的。例如,在一些研究中,为了提高毕赤酵母对特定底物的利用效率或增强其对环境压力的耐受性,会在培养基中添加一些特殊的成分,如氨基酸、有机酸、多糖等;或者通过调整培养基中碳源、氮源和无机盐的比例,来优化酵母细胞的生长和代谢途径,从而实现更高的发酵效率和产物产量。
3、发酵工艺参数
在毕赤酵母发酵过程中,工艺参数的精确控制对于发酵的成功与否起着至关重要的作用,这些参数包括 pH、温度、溶氧等,它们相互关联、相互影响,共同决定了毕赤酵母的生长状况、代谢活性以及外源蛋白的表达水平。
pH值:是影响毕赤酵母发酵的关键因素之一。毕赤酵母在不同的生长阶段和代谢过程中,对 pH 值的要求有所不同。在细胞生长阶段,一般适宜的 pH范围为 5.0 - 6.0,在此 pH 条件下,酵母细胞能够保持良好的生长状态,酶的活性也能得到较好的发挥,有利于细胞的增殖和代谢产物的积累。pH值在毕赤酵母的发酵过程中,不仅会影响菌体的生长状态,而且对外源蛋白的表达也会产生重要影响。pH值对毕赤酵母的影响主要包括以下方面:(1)影响细胞内酶的活性,进而影响细胞的新陈代谢,从而使外源蛋白的表达也受到影响;(2)影响细胞膜的通透性,对细胞吸收营养物质和排出代谢产物时产生一定的影响;(3)pH值会对培养基中成分和细胞的代谢产物的离解产生影响,从而对细胞吸收营养物质造成影响;(4)pH值也可能对细胞的代谢过程产生影响,使细胞代谢产物的含量发生改变另外,在高密度发酵过程中,为了减少外源蛋白被蛋白酶降解,应避开蛋白酶作用的最适pH值,将pH 值设定在偏离外源蛋白等电点处,也会提高外源蛋 白的收获率。
温度:对毕赤酵母的生长和代谢也具有显著影响。毕赤酵母的生长温度一般在 28 - 30℃之间较为适宜。在这个温度范围内,酵母细胞的生长速度较快,代谢活动旺盛,能够高效地利用培养基中的营养物质进行生长和繁殖。然而,如果温度过高,超过 32℃,可能会导致细胞死亡,因为高温会破坏细胞的膜结构、蛋白质和核酸等生物大分子的稳定性,从而影响细胞的正常生理功能。相反,在较低的温度下,虽然细胞的生长速度会减慢,但一些研究表明,适当降低培养温度可以改善靶蛋白的产量和质量。这是因为低温可以降低细胞内蛋白质折叠的应力,减少错误折叠的发生,同时也能减少蛋白酶的活性,降低外源蛋白的水解程度,从而有利于外源蛋白的正确折叠和积累。
溶氧(DO):是毕赤酵母发酵过程中另一个关键的工艺参数。毕赤酵母在利用甘油和甲醇进行生长和代谢时都需要氧气的参与,因此维持合适的溶氧水平对于确保发酵的顺利进行至关重要。在整个发酵过程中,通常需要将溶氧浓度维持在>20% 的水平。在细胞生长初期,由于菌体数量较少,对氧气的需求相对较低,此时通过适当的通气和搅拌即可满足细胞的溶氧需求。随着细胞的生长和代谢活动的增强,对氧气的消耗逐渐增加,此时需要进一步调整通气量、搅拌速度或采用纯氧补充等方式来提高溶氧水平,以保证细胞能够获得足够的氧气进行代谢。如果溶氧不足,可能会导致细胞生长缓慢、代谢产物积累减少,甚至会引起细胞死亡,从而严重影响发酵的效率和产物的产量。
培养时间:是在毕赤酵母表达系统中获得最高蛋白表达水平的最关键因素之一,在毕赤酵母表达系 统中,生产时间相对较长(约100h)。培养时间与 酵母细胞的数量和目标蛋白的降解程度有关,有研 究表明,巴斯德毕赤酵母细胞的最高生长密度是培 养96h,而最高蛋白表达发生在48h[11],这表明 较长的培养时间很可能会导致所表达蛋白被水解消 化,也有其他的研究表明最佳蛋白质表达时间发生 在培养72~96 h[2
毕赤酵母发酵工艺是一个复杂而精细的过程,需要对发酵阶段、培养基配方和工艺参数进行精确的控制和优化,可以通过实验设计(DOE)方法,系统地优化发酵条件,如pH、温度、溶氧和培养基组成以充分发挥毕赤酵母的优势,实现外源蛋白的高效表达和生产。通过深入了解毕赤酵母的发酵特性和需求,结合先进的发酵技术和设备,不断优化发酵工艺,有望进一步提高毕赤酵母发酵的效率和产物质量。
四、毕赤酵母与发酵罐的 “默契配合”
在毕赤酵母的发酵过程中,发酵罐作为核心设备,为毕赤酵母的生长和代谢提供了关键的环境条件,确保其能够高效表达外源蛋白。
发酵罐通过精确的温度控制系统,为毕赤酵母提供适宜的生长温度。如前所述,毕赤酵母在 28 - 30℃的生长阶段以及在诱导表达阶段对温度的特定要求,发酵罐的温控系统能够精准地维持在这些设定温度范围内,避免温度过高或过低对酵母细胞生长和蛋白表达的不利影响。在大规模发酵生产中,这种精确的温度控制尤为重要,它保证了每一批次的毕赤酵母都能在稳定且适宜的温度环境下生长,从而提高了生产的稳定性和重复性。
对于 pH 值的调控,发酵罐配备了先进的 pH 检测和调节装置。在毕赤酵母发酵的不同阶段,根据其对 pH 值的需求变化,发酵罐能够自动添加酸碱溶液,将 pH 值精确维持在所需范围内。在细胞生长阶段保持 pH 5.0 - 6.0,诱导表达阶段调整到 3.0 - 5.0,这种精准的 pH 控制有助于维持酵母细胞内酶的活性,促进细胞的正常生长和代谢,同时减少外源蛋白的降解,提高蛋白的产量和质量。
溶氧水平的控制也是发酵罐的关键功能之一。毕赤酵母在发酵过程中对溶氧需求较高,发酵罐通过合理的通气系统和搅拌装置,确保溶氧浓度始终维持在>20% 的水平。通气系统能够向发酵液中均匀地通入空气或氧气,而搅拌装置则通过不断搅拌,使氧气在发酵液中充分分散,提高氧气的传递效率,满足毕赤酵母在不同生长阶段对氧气的需求,保证其代谢活动的正常进行,进而促进外源蛋白的高效表达。
搅拌和通气系统的协同作用还能保证发酵液中的营养物质均匀分布,避免出现局部营养缺乏或过剩的情况,使每一个毕赤酵母细胞都能在良好的营养环境下生长。同时,发酵罐的密封性能也十分重要,它能够防止外界杂菌的污染,确保毕赤酵母发酵过程的纯净性和稳定性,避免因染菌而导致的发酵失败或产物质量下降等问题。
锦维生工的发酵罐产品正是基于这些关键需求进行设计和制造的,拥有先进的温度控制、pH 调节、溶氧控制以及高效的搅拌和通气系统,能够为毕赤酵母的发酵提供优化的环境条件,帮助用户实现高效、稳定的毕赤酵母发酵生产,无论是在实验室小试阶段还是工业大规模生产中,都能发挥出的性能,满足不同用户对毕赤酵母发酵的各种需求,助力生物技术产业的蓬勃发展。我们将持续关注毕赤酵母的研究动态和应用需求,不断优化和创新发酵罐的设计与制造技术,提升发酵罐的性能和稳定性,为毕赤酵母的发酵生产提供更加先进、高效的设备支持,共同推动生物技术产业迈向更加辉煌的未来。
锦维生工发酵罐介绍
Jimway-be® Lab系列 ------ 桌面级反应器
Jimway-be® PM系列 ------多联生物反应器
适用场合:原核/真核细胞的培养和发酵和表达
培养皿容积: 250ml/500ml/1L/3L/5L/10L
单元数量: 2-16联
培养方式: 悬浮&贴壁
桨叶类型: 三斜叶、六斜叶、六平叶、半管式、提升桨等多种组合
传动方式:磁力耦合驱动/机械搅拌
控制策略:PID&阶梯式控制策略(补料、搅拌转速、温度、通气等)
补料控制:精确补料控制(误差±1g)
功能特点:
界面简洁:几分钟掌握操作,事半功倍
无人值守:可远程访问、操作,实现无人值守
配方功能:配方一键下发,减少人员操作失误,提高品质
数据分析:实现多批次数据对比,也可外接Doe&PAT实现深度多变量分析,优化工艺数据
数据分享:基于VPN的WEB发布,在保证数据安全和设备安全的情况下,实现移动端(Android、IOS、Windows)的监控和历史曲线查看