间充质细胞（MesenchymalStemCells，简称MSC）是一类具有多向分化潜能的干细胞，广泛存在于多种组织中，如骨髓、脂肪、脐带、牙髓等。由于其分化潜能强、免疫调节功能显著，间充质干细胞在组织工程、再生医学、免疫治疗等领域有着广泛的应用。
操作细则涉及间充质细胞的分离、培养、鉴定、扩增及储存等环节。以下是操作过程中常见的步骤和注意事项。
一、间充质细胞的分离
组织取样
常见的组织来源包括骨髓、脂肪、脐带、牙髓等。选择适当的组织并进行消毒，避免污染。
取样时需注意无菌操作，避免外源性污染。
组织消化
使用酶（如胶原酶、胰蛋白酶）对组织进行消化，分解组织基质，使细胞能够脱落。
消化过程通常控制在37°C下进行，时间一般为30分钟至1小时，具体根据组织类型和酶的种类来调整。
必须注意酶的浓度、消化时间以及温度，避免细胞损伤。
细胞收集
消化完成后，加入培养基停止酶的活性，经过离心收集细胞。
使用细胞筛（一般为70μm筛网）过滤，去除未完全消化的组织块。
细胞洗涤
通过离心洗涤细胞3次，去除血液成分、死细胞及残留的酶。
洗涤后用适当的培养基重悬细胞，调节细胞浓度。
细胞培养
将细胞接种到培养瓶中，加入含有10%-20%胎牛血清（FBS）和其他生长因子的培养基，培养在37°C、5%CO₂的恒温培养箱中。
二、间充质细胞的培养
培养基选择
常用的培养基为DMEM（低葡萄糖）或α-MEM等，添加10%-20%FBS和1%青链霉素（抗生素）作为标准培养基。
为提高细胞生长，可能还需要添加一些特定的生长因子，如表皮生长因子（EGF）、基本成纤维生长因子（bFGF）等。
细胞培养条件
培养温度：37°C。
CO₂浓度：5%。
相对湿度：大约95%。
细胞传代
间充质细胞通常在80%-90%融合时进行传代。
传代时，使用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化细胞，避免长时间消化。
细胞处理后，离心收集并重悬，接种至新的培养瓶中，按照适当的细胞密度分配。
细胞密度与培养瓶
一般建议的接种密度为5000-10000个细胞/cm²。
传代时，保持细胞在适当的接种密度范围内，以免细胞因过度密集而相互抑制生长。
细胞状态监控
定期观察细胞形态，健康的间充质细胞通常呈现梭形或纺锤形。
细胞培养基需定期更换（一般为每2-3天），保持细胞生长的最佳环境。
三、间充质细胞的鉴定
形态学鉴定
间充质细胞在培养时呈梭形、长条状，形成单层、较为均一的细胞层。
表面标志物检测
采用流式细胞仪检测细胞表面标志物，通过免疫荧光法或抗体染色法检测MSC的特异性表面标志物。
常见的标志物：
阳性标志物：CD73、CD90、CD105。
阴性标志物：CD34、CD45、CD14。
分化潜能检测
间充质细胞具有分化成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞的潜能，常通过诱导分化实验来检测。
骨分化：通过ALP（碱性磷酸酶）、钙盐沉积染色（如茜素红染色）检测。
软骨分化：通过突触蛋白染色、甲硫氨酸染色等方法检测。
脂肪分化：使用油红O染色检测脂肪小滴。
基因表达检测
PCR、RT-PCR等方法检测MSC相关基因的表达，如Osterix、Runx2、PPAR-γ等基因。
四、间充质细胞的冻存与复苏
冻存
细胞在传代后需进行冻存时，加入适量的冻存液（通常为10%-20%DMSO）和10%-20%FBS，混合后将细胞分装入冻存管。
冻存时，先在-80°C的冰箱中缓慢降温，12小时后转入液氮罐储存。
复苏
取出冻存管，快速将细胞复苏于37°C水浴中，尽量减少复苏时间。
复苏后，立即将细胞接种到含有培养基的培养瓶中，避免细胞受到高浓度DMSO的伤害。
细胞复苏后需要密切观察，若细胞恢复良好，则可以按常规方式进行培养。
五、常见注意事项
无菌操作：所有操作应在无菌条件下进行，尤其是细胞分离、培养、传代等过程，避免细菌、真菌等污染。
细胞密度控制：过高或过低的细胞密度都会影响细胞生长，因此在传代时需要保持适宜的接种密度。
细胞监测：定期检查细胞生长状况，及时更换培养基，并观察细胞是否有污染或病变迹象。
冻存操作谨慎：冻存液浓度不当或冻存操作不当可能导致细胞死亡，因此操作时要小心，确保细胞存活率。
通过以上操作细则，可以确保间充质细胞的高效分离、健康培养和可靠鉴定，为后续的研究和临床应用奠定基础。
