一、miRNA提取的方法
miRNA提取的难点在于其分子太小，不易被醇类沉淀，也不易被常规的硅胶吸附膜吸附。miRNA的提取方法主要有两种形式，一种是提取样品中的总RNA后，通过PAGE电泳或PEG，将总RNA中的小片段RNA分离出来，最后对小片段的RNA进行沉淀回收，从而获得miRNA。另一种是硅胶柱吸附法，采用特殊硅基质吸附材料在添加适量乙醇的条件下，可特异吸附小片段RNA（小于200nt），最终得到miRNA。传统方法提取miRNA通常采用第一种，而miRNA提取试剂盒一般采用硅胶柱吸附法。前者的主要缺点在于实验步骤较为繁琐，影响因素较多，最终获得的miRNA纯度较差，不利于后续实验；而后者操作简便，获得的miRNA纯度良好。
二、miRNA提取的操作流程
miRNA提取
Vazyme动物细胞和组织miRNA柱式提取试剂盒-MiPure Cell／Tissue miRNA Kit（ Vazyme #RC201)。
·Vazyme ＃RC201产品优势
1．高效的提取效率：有效分离长度20～200nt的小片段RNA。
2．简便的操作流程：结合高效的RNA Isolater抽提试剂和硅胶柱纯化技术，1h内完成miRNA提取。
3．广泛的适用性：提取的miRNA纯度高，兼容常规qPCR、Northern杂交、芯片分析及miRNA文库构建。
Vazyme ＃RC201实验案例-一非常高的提取效率
使用 MiPure Cell ／Tissue miRNA Kit （Vazyme ＃RC201）与total RNA提取试剂（Trizol）分别从等量样本（细胞或小鼠肝脏组织）中提取miRNA、total RNA，琼脂糖凝胶电泳检测等量产物，结果如下图所示：对于细胞或小鼠组织，Vazyme ＃RC201提取得到的产物中不含有大分子RNA，如18S、28S rRNA。通过qPCR实验检测等量产物中miR-16基因，结果显示，Vazyme ＃RC201 对于miRNA的提取产量优于Trizol法。
注意事项
1．本制品的裂解液RNA Isolater中含有C6H6O，具有毒性和腐蚀性。如果吸入体内、接触皮肤、吞食等会导致中毒、灼伤以及其他身体伤害。使用本制品时应穿戴防护物品，如防护服装、手套、面罩等。
2．所有操作步骤，如果没有特别指出，均在常温条件下（15～25℃）进行。
3．RNA得率和质量与组织样本用量和洗脱体积有关，建议每1ml RNA Isolater 裂解 10～100mg组织，或不多于5x106个细胞。洗脱体积应不少于30μl，否则会影响RNA的得率。
4．使用本试剂盒时，请穿戴实验服、一次性乳胶手套、一次性口罩等，最大限度的避免RNase 污染。
5．样本的选择及保存会很大程度上影响RNA的产量以及质量。应尽可能的采用新鲜的动物组织或细胞进行RNA提取。如果采集的样本暂不提取RNA，可以将新采集的样本立即置于液氮中速冻后于-70℃保存，并且避免反复冻融，或者将样本立即置于RNA Isolater裂解液中匀浆后，置于-70℃保存。为了避免RNA的降解，样本的采集与保存应尽可能迅速地进行。
6．样本破碎需全部破坏细胞膜及细胞器以释放RNA，破碎不充分将影响RNA的产量，匀浆时尽量低温，防止因匀浆过程中产生的热量导致RNA降解。
7．RNA在RNA Isolater中不会被 RNase 污染，但裂解后处理过程应保证RNase-free环境。
8．本试剂盒可去除体系中基因组DNA，纯化获得的RNA通常无需使用DNase处理即可用于下游实验操作。如果下游实验对痕量的DNA十分敏感，可以选用商业化RNase-freeDNase 全部清除。
实验流程
1．样品的处理
样品的均质化处理是所有RNA提取所必需的步骤。通过吹打或匀浆让细胞或组织块快速分散、细胞壁和细胞质膜破裂，从而使核酸释放到裂解液中。均质化不充分可能会导致RNA产量和纯度下降。下面列举了几种常见的样品均质化处理方法：
1.1 液氮处理
切取适量组织称重，置于预冷的研钵中，迅速加入液氮，将组织研磨成粉末，然后将粉末倒入预冷的离心管中（注意：预先冷却离心管，否则样品倒入时，液氮沸腾会造成样品损失）。待液氮全部挥发后，加入适量的RNA Isolater涡旋混匀。由于液氮研磨只能起到打散样品的作用，所以最好再用注射器吹打或机械匀浆器匀浆，以降低裂解液的粘稠度。
1.2机械匀浆器匀浆
机械匀浆器能高效匀浆大部分组织和细胞，并同时起到打散和匀浆的作用。把样品置于合适的1～5ml玻璃管或离心管中，加入RNA Isolater，把转子插入RNA Isolater中，低温高速间断匀浆，每次为10～30sec，间隔相同时间直至样品全部匀浆。使用机械匀浆器时，一般组织都可以在一分钟内达到理想的匀浆效果。大部分的机械匀浆器都带有不同大小的转子，小体积的裂解液适合使用较小的转子。
1.3 玻璃匀浆器
把样品和适量的裂解液转移至玻璃匀浆器中，上下推磨直至组织块被充分打散。
2．RNA的提取
小分子RNA的提取可分为细胞小分子RNA和动物组织小分子RNA，不同小分子RNA的提取均可使用Vazyme ＃RC201，提取原理及流程概要如下：
2.1 细胞小分子的RNA的提取
该方案适合于从少于5x106个培养细胞样品中富集小分子RNA（＜200nt）。
（1）收集细胞。
a．悬浮培养细胞：计算细胞数量，300g离心5min收集细胞，小心弃除培养液，按2.1中的第2步进行操作。
b.贴壁细胞：贴壁细胞可在培养瓶／皿中直接裂解，也可经胰酶消化后离心收集。
直接裂解：计算细胞数量，全部弃除培养液，按2.1中的第2步进行操作。
胰酶消化处理：计算细胞数量，弃除培养液，加入适量PBS清洗细胞，弃除PBS，再加入含0.1～0.25％胰酶（Trypsin）的PBS消化细胞。当细胞从壁上脱落后，加入含血清的培养液，并转移至离心管，300g离心5min。收集细胞，按2.1中的第2步进行操作。
（2）加入1ml RNA Isolater至细胞样品中，涡旋或吸打处理细胞沉淀团。
离心收集的细胞：先弹打使细胞松散，再加入1ml RNA Isolater，用移液枪吸打10～15次全部打散细胞。贴壁细胞直接裂解：全部弃除培养液后，向培养瓶或培养皿中加入1 ml RNAIsolater。用枪吹打使细胞从壁上全部脱落，收集裂解液，并转移至离心管中。
（3）室温放置2～3min 让细胞充分裂解。
此时样品可在2～8℃保存一周，-20℃至-70℃保存六个月以上。
（4）加入200μlCHCL3至裂解液中，用手剧烈振荡15sec，室温静置3min。
用涡旋取代振荡可能会带入基因组DNA污染。
（5）4℃，12,000 rpm（13,400xg）离心15 min。吸取500μl的上清液至新的1.5ml离心管中。
请小心吸取上清水相，避免吸到中间层和下层有机相而影响后续提取结果。
（6）加入160μl的无水乙醇至上清液中，涡旋混匀10sec。（以下离心均在室温下进行）
（7）把RNA柱（MiPure RNAspin Column）置入2ml收集管（Collection Tube）。将上述混合液转移至RNA柱中12,000rpm（13,400xg）离心30 sec。
（8）加入0.9倍体积的无水乙醇至滤液中，用移液枪吸打混匀3～5次。
举例：若滤液体积为640μl，则需加入576μl无水乙醇。
（9）把miRNA柱（MiPure miRNA Column）置入2ml收集管中。转移一半体积的混合液至miRNA柱中12,000rpm（13,400xg）离心30 sec。
（10）弃滤液，把miRNA柱置回收集管中。转移剩余混合液至miRNA柱中，12,000 rpm（13,400xg）离心30sec。
（11）弃滤液，把miRNA柱置回收集管中。加入500 μl Buffer miRW1（已加乙醇）至miRNA柱中，室温放置1min，12,000 rpm（13,400xg）离心30sec。
（12）弃滤液，把miRNA柱置回收集管中。加入500 μl Buffer miRW2（已加乙醇）至miRNA柱中，室温放置1min，12,000 rpm（13,400xg）离心30sec。
（13）弃滤液，把miRNA柱置回收集管中。加入500μl80％乙醇（需用RNase-freeddH2O新鲜配制）至miRNA柱中，室温放置1 min，12,000 rpm（13,400xg）离心30 sec。
（14）弃滤液，把miRNA柱置回收集管中。12,000rpm（13,400xg）离心空柱2min，甩干miRNA柱的基质。这一步可全部去除miRNA柱中残留的乙醇。
（15）将miRNA柱转移至新的1.5ml离心管，室温晾干2~5min,加入MiPure miRNA Column 最小的洗脱体积是30μl，小于30μl会致RNA的洗脱效率下降。
（16）丢弃miRNA柱，收集的miRNA样品于-70℃保存。
2.2 动物组织小分子RNA的提取
该方案适合于从少于100mg动物组织中富集小分子RNA（＜200nt）。
（1）组织用量：组织用量是RNA产量和纯度的关键因素。试剂盒的组织用量可低至0.01mg，但最大的组织用量取决于样品中RNA、蛋白质和杂质的含量。
动物脑组织、脂肪组织，RNA含量较低，组织最大用量可至100mg。
动物肝脏、脾脏、肾脏、胸腺等，含有丰富的RNA，组织用量不要超过20mg。
心脏、肌肉、皮肤含有中丰度的RNA，组织用量不要超过50mg。
＊MiPure miRNA Column结合能力为200μg。过多的组织用量会造成RNA降解及大分子RNA的污染。如果处理的组织没有相关的信息，推荐第一次起始用量为30mg，根据获得的结果来提高或降低组织的用量。
（2）组织的裂解和匀浆：按10～100mg的组织量，加入1ml RNA Isolater。
（3）室温放置2～3min让组织充分裂解。
（4）（可选）4℃，12,000rpm（13,400xg）离心10min。小心吸取上清液至新的离心管中。
处理脂肪样品时，离心后溶液表面会飘浮一层油脂类，小心转移下层清液至新管。
（5）加入200μlCHCL3至裂解液或上清液中。用手剧烈振荡15 sec，室温静置3min。
用涡旋取代振荡可能会带入基因组DNA污染。
（6）4℃，12,000 rpm（13,400xg）离心15min。吸取500μl上清液至新的1.5ml离心管中。
请小心吸取上清水相，避免吸到中间层和下层有机相而影响后续提取结果。
按2.1的第6～16步进行操作富集小分子RNA。
三、miRNA提取的常见FAQ
离心后分层不明显？
1．没有加CHCL3或CHCL3不纯：确保加入CHCL3，且不含有3-甲基丁醇或其它添加成分。
2．加入CHCL3后混匀效果不好：加入CHCL3后，一定要剧烈振荡混匀15sec。颠倒或涡旋会导致分离不明显或引入DNA污染。如果离心后分离不明显，重复振荡和静置，然后再离心。
3．样品中含有机溶剂：若样品含有有机溶剂如DMSO、乙醇、强碱试剂会影响分层。
RNA产量低？
1．样品匀浆不充分：处理培养细胞时，反复吹打裂解液进行裂解；处理动物组织时，推荐使用机械匀浆器匀浆。
2．样品起始用量太多：根据说明书给出的参考用量及实际情况来决定样品用量。
3．RNA的洗脱效率低：RNase-free ddH2O没有加到膜上，或洗脱体积不够。可加入预热的30～50 μl RNase-free ddH2O到膜上，室温静置2min，然后离心洗脱RNA。
RNA降解？
1．组织／细胞用量太多：减少样品用量，正确的样品用量是获得理想结果的必要条件。
2．RNase 污染：操作过程避免RNase的污染。戴一次性干净手套；在单独洁净的区域操作；戴口罩并在操作过程中避免讲话；使用RNase-free的实验器具，包括枪头和离心管；RNA实验所用器具与试剂都应专用，避免混用后造成交叉污染；RNase-free ddH2O建议分装后保存。
下游实验结果不理想？
1．盐分污染：加入Buffer miRW2或80％乙醇后，静置2min后再离心。
2．乙醇污染：空柱离心转速高于或等于12,000rpm（13,400xg），离心时间为2min。
3．膜材料脱落：脱落到产物中的硅胶膜是不溶解的，可通过12,000rpm（13,400xg）离心2min，仅分离含有小RNA的液体成分保存。
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