一、miRNA 逆转录及实时荧光定量 PCR的概念
miRNA逆转录的概念
成熟miRNA的长度只有21~23nt，对miRNA进行qPCR定量时，无法直接对其进行正、反向引物的设计（通常正向引物就足以覆盖miRNA全长），但是可以通过增加逆转录产物长度来解决这一问题，miRNA的逆转录方法有两种，分别是茎环法和加尾法。
实时荧光定量PCR的概念
实时荧光定量PCR即Real-time PCR,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过Cr值和标准曲线对未知模版进行定量分析的方法。
二、miRNA逆转录及实时荧光定量PCR的原理
茎环法原理
茎环法miRNA逆转录最关键的一步就是设计茎环逆转录引物（由茎环结构和miRNA的3'末端六个反向互补的碱基组成），茎环逆转录引物首先与miRNA的3'末端结合，在逆转录酶的作用下进行反应，获得人为加长的miRNA第一链cDNA。针对不同的miRNA，需要设计不同的茎环逆转录引物、配制不同的逆转录体系，因此茎环法miRNA逆转录具有特别高的特异性。
注：茎环逆转录引物中的茎环结构为固定已知序列，只需按照不同的miRNA序列3'末端的六个碱基，将其反向互补添加至茎环结构序列的3'端即可设计出特异性的茎环逆转录引物。
加尾法原理
增加miRNA逆转录产物长度最直接的方法就是增加miRNA的长度，加尾法首先通过Poly（A）聚合酶（PAP）向miRNA的3'末端添加Poly（A）尾，然后在逆转录酶的作用下，结合逆转录引物（由3'端带有锚定碱基的Oligo dT序列和一段通用序列组成），即可获得加长版的cDNA。加尾法逆转录可以对提取纯化的所有miRNA进行无差别加尾，能够同时逆转样本中多个miRNA，一次逆转录即可完成对所有qPCR模板的制备。
注：锚定碱基NV（V代表A、G或C，N代表ATGC中的任意一种）能够特异性的结合到Poly（A）的5'端，以免逆转出更多的T碱基，保证同一miRNA的逆转录产物大小相同；在Oligo dT序列的5'端存在一段可用于qPCR检测的反向通用引物与cDNA的结合。
2、荧光定量PCR的化学原理
变产物DNA分子为荧光信号，通过测定荧光值即可反映产物DNA分子量，实时荧光定量PCR的化学方法有两种，分别是SYBR®Green染料法和 TaqMan®Probe探针法。
SYBR®Green 染料法原理
一种DNA小沟非饱和性结合染料，与DNA结合时发光，不结合（游离）时不发光，每形成一条DNA双链，就会有一定数量的染料结合上去，染料一结合，就会产生荧光信号，信号强度与DNA分子总数目成正比。
TaqMan®Probe探针法原理
一种水解探针（5'Reporter，3'Quencher），完整时不发光，水解后发光，每形成一条DNA链，就会水解一条探针，每水解一条探针，就会产生一个单位信号，信号强度与结合过探针的DNA分子总数目成正比。
注：探针要先于引物结合在模板上，因此Tm（探针）要比Tm（引物）大8～10℃。
SYBR®Green 染料法 VS TaqMan®Probe探针法原理
SYBR®Green 染料法：表达量比较高时推荐使用；
TaqMan®Probe 探针法原理：表达量比较低时推荐使用；
三、miRNA逆转录及实时荧光定量PCR的操作流程
1.茎环法miRNA逆转录反应
Vazyme 茎环法 miRNA cDNA 一链合成的专用试剂盒 ----------miRNA 1st Stand cDNA Synthesis kit（by stem-loop）(Vazyme #MR101)
Vazyme #MR101 产品优势
1.优秀的线性关系：在宽广的模版区间内具有良好的线性关系，可检出低至pg级RNA模版。
2.优秀的反应体系：最适的Buffer组分及浓度，更适用于miRNA的逆转录。
3.简便的引物设计：提供配套的引物设计软件，使得引物设计更加简便。
Vazyme #MR101实验案例-----优秀的线性关系
以小鼠肝脏组织Total RNA的10倍稀释梯度（10pg～1μg）为模板，使用miRNA 1st StrandcDNA Synthesis Kit （by stem-loop） （Vazyme ＃MR101）进行逆转录，得到的cDNA使用miRNA Universal SYBR qPCR Master Mix（Vazyme ＃MQ101）扩增mmu-miR-16基因。结果显示， 在宽广的模板区间内，该配套产品具有优异的线性关系。
·注意事项
1．防止RNase污染：保持实验区域洁净；操作时需穿戴干净的手套、口罩；实验所用的离心管、枪头等耗材均需保证RNase-free。
2.5xgDNA Wiper Mix的使用：5xgDNA Wiper Mix含有高浓度的甘油，使用前请短暂离心收集到反应管底部，并用移液器轻轻吹打混匀。不应使枪头插入液面过深，否则会因枪头壁的粘附造成酶量的损失。
3．反应液的配制请在冰上操作完成。
·实验流程
1．基因组DNA去除
a.在RNase-free 离心管中配制如下混合液：
用移液器轻轻吹打混匀。
b.按下列条件进行基因组DNA去除反应：42°C 2min。
2.第一链cDNA合成
a.在RNase-free离心管中配制如下混合液：
茎环引物推荐使用本公司miRNA Design软件进行设计，此时，cDNA产物后续定量产品--miRNAUniversal SYBR qPCR Master Mix（Vazyme ＃MQ101）中配套的逆向qPCR引物可直接使用，无需另外设计合成。
用移液器轻轻吹打混匀。
b.按下列条件进行第一链cDNA合成反应：
如果模版具有复杂二级结构或高GC区域，可将反应温度提高至55°C，有助于提高产量。
产物可立即用于qPCR反应，短期保存建议存放-20°C；长期保存建议存放-70°C；cDNA应避免反复冻融。
2、加尾法miRNA逆转录反应
Vazyme 加尾法 miRNA逆转录是无法使用普通的逆转录试剂盒进行逆转录的，因为其缺少Poly（A）聚合酶，无法添加Poly（A）尾。Vazyme为您提供加尾法miRNA合成cDNA的专用试剂盒-miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit（by tailing A）（Vazyme ＃MR201）。
·Vazyme ＃MR201 产品优势
1．特别优秀的逆转录性能：逆转录效率高且熔解曲线单峰。
2．超高的逆转录特异性：专为miRNA逆转录定向改造的逆转录酶，搭配优化的缓冲体系，在保证高灵敏度的同时，最大限度降低 miRNA前体的逆转录。
3．简便快捷的操作：加尾反应与逆转录反应一管进行，使得操作更加方便。
·Vazyme ＃MR201 实验案例一一超高的逆转录特异性
以HeLa miRNA为模板（100ng／μl），分别使用专为miRNA逆转录定向改造的逆转录酶（Vazyme＃MR201）和未定向改造的逆转录酶（其余组分与Vazyme ＃MR201一致）进行逆转录反应，在相同条件下对逆转录反应得到的cDNA进行qPCR检测2个体系。可以看到，使用Vazyme ＃MR201逆转录 miRNA后qPCR检测得到的熔解曲线单峰且峰形优异，特异性更高。
注意事项
1.防止RNase污染：保持实验区域洁净；操作时需穿戴干净的手套、口罩；实验所用的离心管、枪头等耗材均需保证RNase-free。
2.反应液的配制请在冰上操作完成。
实验流程
1.在RNase-free离心管中配制如下混合液：
反应中使用的Total RNA必须含有miRNA。
用移液器轻轻吹打混匀。
2.按下列条件进行第一链cDNA合成反应：
反应得到的cDNA可立即或稀释后用于荧光定量，对于高丰度表达的miRNA，可根据具体的Cr值，稀释10~1000倍。
cDNA应避免反复冻融，短期保存建议存放-20°C；长期保存建议存放-70°C。
3、茎环法／加尾法miRNA实时荧光定量PCR
Vazyme 提供 SYBR Green I嵌合荧光法进行miRNA定量反应的专用预混液-miRNA Unimodal SYBR qPCR Master Mix（Vazyme ＃MQ102），可同时兼容茎环和加尾逆转产物。
Vazyme ＃MQ102 产品优势
1.高效实验：附赠U6内参上下游引物，配备茎环通用下游引物及相关设计软件。
2.高灵敏度：可在pg级的总RNA中检测目的miRNA。
3.强特异性：区分单碱基的差异，非特异识别率低于5%。
Vazyme #MQ102 实验案例--高效实验
Vazyme #MQ102配备了miRNA 茎环引物设计软件和配套下游通用茎环引物，同时附赠人、大鼠、小鼠通用的U6内参上下游引物，可在宽广的定量范围内得到良好的标准曲线。
Vazyme #MQ102 实验案例--高灵敏度：
以293T细胞RNA为模版稀释6个梯度（1pg-100ng），用miRNA 1st Stand cDNA Synthesis Kit(by stem-loop)(Vazyme #MR101)进行反转录，获得的cDNA用Vazyme
＃MQ102 检测hsa-miR-21-5p基因表达情况。结果显示，Vazyme ＃MQ102可在pg级的总RNA中检测目的miRNA,且能在宽广的定量范围内得到良好的标准曲线。
Vazyme #MQ102 实验案例--强特异性：
miRNA序列短，同一家族不同成员序列非常相似，有些仅有单个碱基差别，因此特异性对miRNA定量至关重要。Vazyme ＃MQ102核心酶以双抗封闭，配以优化的Buffer，能够区分单碱基的差异，非特异识别率低于5％，实现高特异性定量。
茎环定量引物设计
1、正向引物：建议根据完整miRNA序列除去3'末端6个碱基的剩余部分作为miRNA正向特异性引物，并将其中的U替换为T。也可使用本司提供的miRNA Design软件设计，软件和说明书请在【诺唯赞-资源支持-实验工具】处下载。
2、反向引物：：茎环法的qPCR反向通用引物为茎环逆转录引物中茎环结构序列的一部分，所用茎环序列为GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC；本产品提供用于qPCR检测的反向通用引物mQ Primer R，与本公司miRNA Design 软件设计的逆转录引物配套，无需另外合成；当使用不同的茎环序列时，需自行设计合成qPCR下游引物。
加尾定量引物设计
1．正向引物：
①建议根据完整miRNA序列设计miRNA正向特异性引物，并将其中的U替换为T。
②若根据miRNA序列设计的正向特异性引物退火温度过低，建议在引物5'端增加几个碱基（以G和C为主），增加碱基后需验证引物特异性，以免造成非特异性扩增；若引物退火温度过高，建议删去5'端几个碱基。
③对于miRNA前体等长片段非特异性扩增，建议在正向特异性引物3'端增加1-3个A碱基。
④对于序列相似的miRNA，建议正向特异性引物3'端终止于差异碱基，若由于引物长度过短而导致退火温度过低，可在引物5'端增加几个碱基，使上下游引物Tm值匹配。反向
2.2、反向引物：本公司Vazyme ＃MR102中提供用于qPCR检测的反向通用引物 Universalreverse Q primer，退火温度约为66℃，无需另外合成；当使用不同的逆转录试剂时，需自行设计合成qPCR逆向引物。
·注意事项
1．本品尽量避免反复冻融，以免造成酶活下降。如每次使用量较少，推荐小份分装使用。
2．使用前请上下颠倒以混匀Master Mix，请勿vortex避免产生气泡，影响定量结果。MasterMix经混匀短暂离心后即可使用。
3．由于本品中含有荧光染料SYBR Green1，因此需避光保存，配制反应体系时应尽量避免强光照射。
4．由于本品检测灵敏度特高，易被空气中气溶胶污染。因此反应体系配制时请于超净工作台内进行，配制过程中请使用灭菌枪头、反应管，条件容许的实验室推荐使用专用的移液枪和带滤芯的枪头。
5．本品中的蓝色染料经测试不影响SYBR GreenI荧光的信号采集。
·实验流程
1．在qPCR管中配制如下混合液
茎环法（相对定量内参体系配制参考右表）
加尾法（相对定量内参体系配制参考右表）
2.按下列条件进行qPCR反应：
miRNA逆转录及实时荧光定量PCR的常见FAQ
1.miRNA逆转录的常见FAQ
茎环法Vazyme＃MR101能否用于加Poly（A）尾法逆转录？
不能。MR101是通过茎环法逆转miRNA，利用茎环引物在逆转录酶的作用下获得cDNA。而加Poly（A）尾法体系中含有两个酶的作用，首先是Poly（A）聚合酶在单链RNA的3'端加上一串Poly（A）尾，然后利用体系中的Oligo dT通用型引物在逆转录酶的作用下进行逆转录反应。MR101中没有Poly（A）聚合酶，故不能用于Poly(A)尾法逆转录。
为什么茎环法Vazyme #MR101带基因组清除组分，而加尾法Vazyme #MR201不带基因组清除组分？
因为MR201中的Poly(A)聚合酶（PAP）不能对基因组DNA进行加尾，逆转录引物无法识别基因组DNA，所以MR201中不带专门基因组清除的组分。
2、实时荧光定量PCR的常见FAQ
·miRNA推荐使用的内参：
small nucleolar RNA（snoRNA）长度约为60～300nt左右，在多种组织细胞中高表达，不涉及miRNA的调节途径，所以snoRNA是很好的内参选择。研究证实常用的snoRNAassays 包括：
Human:U6、RNU48、RNU44、U47;
Mouse:U6、snoRNA-202、snoRNA-234、snoRNA-420;
还有一类是在不同实验条件下变化差异很小的miRNA：
Human/mouse tissues: miR-152、-186、-25、-92、-26b、-16;
Human/mouse cell lines: miR-374、-16、-93、-186、-26b;
还有一类是传统沿用的18S rRNA or U6。
茎环法miRNA做逆转、定量时，内参的逆转录引物和qPCR引物如何设计？以常用的U6内参为例，U6的序列足够长，因此不需要设计茎环引物（当内参产物长度在80bp以上时就不需要设计茎环引物），U6在逆转录的时候投入qPCR下游引物即可，可以看作投入逆转录的特异性引物逆转，后续qPCR定量的时候正常投入上下游引物即可。
加尾法miRNA做逆转、定量时，内参的逆转录引物和qPCR引物如何设计？加尾法逆转录可以对提取纯化的所有mRNA和miRNA进行无差别加尾，因此不需要对内参做单独处理。
扩增曲线形状异常？
1．扩增曲线不光滑：信号太弱，经系统矫正后产生，提高模板浓度重复实验。
2．扩增曲线断裂或下滑：模板浓度较高，基线的终点值大于C4值。减小基线终点（C1值-4），重新分析数据。
3．个别扩增曲线突然骤降：反应管内留有气泡，处理样本时要注意离心，进行扩增反应之前要仔细检查反应管内是否有气泡残留。
反应结束无扩增曲线出现？
1．反应循环数不够：一般设置循环数为40，但需要注意的是过多的循环会增加过多的背景信号，降低数据可信度。
2．确认程序中是否设置了信号采集步骤：两步法扩增程序一般将信号采集设置在退火延伸阶段；三步法扩增程序应当将信号采集设置在72℃延伸阶段。
3．确认引物是否降解：长时间未用的引物应先通过PAGE电泳检测完整性，以排除其降解的可能。
4．模板浓度太低：减少稀释度重复实验，一般未知浓度的样品先从最高浓度做起。
5．模板降解：重新制备模板，重复实验。
Cr值出现太晚？
1．扩增效率极低：优化反应条件，尝试三步法扩增程序，或者重新设计合成引物。
2．模板浓度太低：减少稀释度重复实验，一般未知浓度的样品先从最高浓度做起。
3．模板降解：重新制备模板，重复实验。
4．体系中存在PCR抑制剂：一般为模板带入，加大模板稀释倍数或者重新制备模板重复实验。
溶解曲线出现多峰？
1．引物设计不优：根据设计原则设计合成新的引物；茎环法可尝试引物设计时向前延伸几个碱基，增加引物特异性。
2．引物浓度太高：适当降低引物浓度。
3．cDNA模板带有基因组污染：重新制备cDNA模板。
·阴性对照出现明显扩增？
1．反应体系污染：更换新的Mix、ddH2O、引物重复实验。反应体系在超净工作台内配制，减少气溶胶污染。
2．引物二聚体的出现：配合熔解曲线进行分析。
实验重复性差？
1．加样体积失准：配制反应体系时尽量使用大体积移液配制，同时使用性能较好的移液枪和低吸附耗材。
2．定量PCR仪不同位置温度控制不一致：定期校准仪器。
3．模板浓度太低：模板浓度越低，重复性越差，减少模板稀释度或提高加样体积。
·绝对定量时标准曲线线性关系不佳？
1．稀释误差：采用逐级稀释法进行模板稀释，配制反应体系时尽量使用大体积移液配制，同时使用性能较好的移液枪和低吸附耗。
2.系计算。
3．引物扩增效率差：根据设计原则设计合成新的引物。
4．标准品降解：重新制备标准品，重复实验。
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