一、Small RNA 的概念
Small RNA是长度小于200nt的一类非编码RNA，承担着关键性的调控功能，主要包括三类，分别是miRNA、piRNA以及 siRNA，其中以miRNA研究最为广泛。Small RNA的5'和3'末端分别有自由的磷酸基和羟基，正是基于这一结构特点，Small RNA测序采用5'、3'两端连接接头法进行Small RNA文库构建。
二、Small RNA建库的原理
1.3'接头连接
将RNA和3'接头置于70℃条件下进行变性，打开RNA及3'接头可能存在的二级结构。利用酶将 Small RNA的3'羟基和3'通用接头进行连接。
2．多余3'接头封闭
为了防止多余的3'接头与5'接头连接产生接头二聚体，在5'接头连接之前，需要将多余的3'接头进行封闭。封闭是通过加入RT Primer与多余的3'接头反向互补形成双链结构，从而有效阻止其与5'接头连接，达到减少接头二聚体的目的。
3.5'接头连接
5'接头连接是基于Small RNA的5'端含有磷酸基团，利用酶将5'接头与Small RNA进行连接。如需要测试的Small RNA 5'端不含磷酸基团，则连接不上5'接头。5'接头为RNA接头，自身可能形成二级结构，使用前需要将5'接头的二级结构打开。
4．cDNA合成
利用3'接头封闭时加入的RT Primer作为引物进行逆转录合成cDNA。
5．PCR富集
使用带有P5、P7的引物进行文库富集。
6．文库分选
扩增后的文库会有扩增引物残留及rRNA污染。纯化后的文库推荐使用PAGE胶进行分选，可直观获得目的条带。也可以使用双轮磁珠分选，但分选范围较广，得到的Small RNA文库纯度较低。分选后的文库miRNA在147bp处左右。
三、Small RNA建库的操作流程
·Small RNA 建库
Vazyme 针对 lllumina 高通量测序平台定向开发的Small RNA文库构建专用试剂盒-VAHTS Small RNA Library Prep Kit for lllumina V2 (Vazyme #NR811)。
· Vazyme ＃NR811 产品优势
1．文库丰度高：接头污染少，有效文库比例高，miRNA比例高、覆盖种类多，文库数据质量可靠；
2．样本兼容范围广：动、植物细胞／组织总RNA，分离纯化的Small RNA，以及其他类型总RNA（如外泌体总RNA）均可作为起始模板；起始模板投入低至10ng总RNA；
3．多种纯化方式可选：NR811中包含文库构建所需的所有组分，提供磁珠分选和PAGE胶分离两种文库纯化方式，可根据起始文库质量任意选择。
自备材料
1.Small RNA Index Primer
VAHTS Small RNA Index Primer Kit for Illumina (Vazyme #N813-816)。
2．RNA质控
Agilent RNA 6000 Pico Kit (Agilent #5067-1513)。
3．文库质控
Agilent DNA 1000 kit (Agilent #5067-1504)、Agilent High Sensitive Kit (Agilent #5067-4626)。
4．文库纯化
VAHTS DNA Clean Beads (Vazyme #N411)。
5．文库分选
5.1PAGE胶分选：
6% Novex TBE PAGE gel 1.0 mM 10-well (Life Technologies #EC6265BOX)、5 x TBE、Ultra GelRed Nucleic Acid Stain （Vazyme ＃GR501）或 SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain（Life Technologies ＃S11494）、3M醋酸钠（pH 5.2）、无水乙醇、新鲜配制的80％乙醇。
5.2磁珠分选：
VAHTS DNA Clean Beads（Vazyme ＃N411）、新鲜配制的80％乙醇。
6．其他材料
Nucleas-free ddH2O、RNase-free PCR管、低吸附EP管（Eppendorf＃022431021）； Agilent 2100 Bioanalyzer或其他等效产品、PCR仪、磁力架、-80℃冰箱、水浴锅、离心机。
·注意事项
1．试剂盒各组分应于标注条件下保存：
1.15'接头RL5 Adaptor为RNA接头，请置于-85～-65℃保存。
1.2 试剂盒中的各酶类组分，请置于-30～-15℃保存。使用前混匀并进行短暂离心，避免粘附于管壁及管盖，造成损失；使用时应置于冰上，使用后及时按条件保存，否则会导致酶活降低。
1.3 RL3 Buffer V2比较粘稠，解冻混匀后请短暂离心收集至管底，避免液体粘附于管盖和管壁，导致试剂损失。
2．RNA样品质控：
为保证建库质量，实验开始前请对RNA样品进行质控，RNA样品总量、纯度和完整性应满足以下条件：
2.1以总RNA为起始模板，请使用沉淀法（如trizol法）或者Small RNA专用提取试剂盒提取RNA样品，确保所使用的提取方法不会损失 Small RNA。
2.2总RNA模板的起始投入量应≥10ng，若起始投入量过低，不能确保文库构建成功。
2.3 OD260／280比值介于1.8-2.2之间，使用Bioanalyzer进行RNA完整性检测，RIN值27；使用琼脂糖凝胶电泳检测，则28S：18S≥1.5，且无蛋白质和基因组污染。
3．操作过程注意事项：
3.1实验过程中请使用RNase-free的枪头、EP管、PCR管，吸取不同样品时请更换枪头。
3.2 请佩戴手套、口罩操作，接触RNase-free空间外设备或其他工作区间后，请更换手套。
3.3 所有的试剂使用后请立即盖上管盖，避免污染。
3.4实验过程中如需暂停，请严格按照使用方法中注明的可停放点将样品置于合适的温度下保存，不正确的停放可能会降低建库成功率。
实验流程
1.3'接头连接
将RL3 Adaptor、RL3 Buffer V2、RL3 Enzyme mix V2取出，解冻并混匀、短暂离心收集至管底，置于冰上备用，以下所有步骤均在冰上操作。
不同起始量RNA投入，所需接头量不同，接头量不足产出不够，接头过量则接头二聚体残留较多。推荐按照下表对接头进行稀释、如血清、血浆、外泌体RNA提取产物低于Qubit测定下限，则按照最大体积6μl投入，推荐按照10ng总RNA接头稀释倍数进行稀释。
1.1 模板与接头变性
将RNA底物自身以及RNA底物之间可能存在的二级结构打开。根据模版RNA起始投入量稀释 RL3 Adaptor，在RNase-free的PCR管中按照下表配制反应体系。
1.2将PCR管置于提前预热至70℃的PCR仪中反应2min，反应结束后立即取出置于冰上2 min。
1.3向1.2的反应管中依次加入如下组分：
1.4使用移液器吹打10-15次充分混匀，短暂离心收集反应液至管底。将反应管置于热盖的PCR仪中运行如下程序：
2．多余3'接头封闭
将RT Primer取出，解冻并混匀，短暂离心收集至管底，置于冰上备用，以下所有步骤均在冰上操作。
2.1 根据模版RNA起始投入量，参照表格稀释RT Primer，再按照下表配制反应体系。
2.2 使用移液器吹打10～15次混匀，短暂离心收集至管底。置于热盖的PCR仪中运行如下程序：
3.5'接头连接
将5'接头RL5 Adaptor、RL5 Buffer和RL5 Enzyme mix取出，解冻并混匀、短暂离心收集至管底，置于冰上备用，以下所有步骤均在冰上操作。
3.1 5'接头变性
RL5 Adaptor 自身可能形成二级结构，使用前需变性打开二级结构。根据模版RNA起始投入量，参照表格稀释RL5 Adaptor，将稀释好的RL5 Adaptor置于提前预热至70℃的PCR仪中反应2min，反应结束后立即取出置于冰上。
3.2 按照下表配制5'接头连接反应体系：
3.3 使用移液器吹打10～15次充分混匀，短暂离心收集反应液至管底。将反应管置于热盖的PCR仪中运行如下程序：
4． cDNA合成
将RT Buffer和 RT Enzyme mix V2取出，解冻并混匀、短暂离心收集至管底，置于冰上备用。
4.1 按照下表配制逆转录反应体系：
4.2 使用移液器吹打10～15次充分混匀，短暂离心收集反应液至管底。将反应管置于热盖的PCR仪中运行如下程序：
5．文库富集
将Universal Primer、Index Primer和 Amplification mix 3取出，解冻混匀后置于冰上备用。5.1 按照下表配制反应体系：
5.2将上述反应液混匀，短暂离心收集至管底。将反应管置于热盖的PCR仪中运行如下反应程序：
6．PCR产物纯化
6.1 将VAHTS DNA Clean Beads提前30 min从2～8℃取出，静置使其平衡至室温。
6.2 颠倒或涡旋振荡使VAHTS DNA Clean Beads 充分混匀，吸取180μl（1.8x）加入到PCR产物中，使用移液器轻轻吹打10次充分混匀。
6.3 室温孵育10min，使DNA结合到磁珠上。
6.4 将样品置于磁力架上，待溶液澄清后（约10min），小心移除上清。
6.5 保持样品始终处于磁力架上，加入200μl新鲜配制的80％乙醇漂洗磁珠，室温孵育30 sec，小心移除上清。
6.6 重复6.5一次。
6.7 保持样品始终处于磁力架上，室温下开盖干燥磁珠约5min。
加入80％乙醇时不要吹散磁珠。
最后移除上清时需使用10μl移液器将残留液体吸干净，避免磁珠过分干燥（龟裂）而降低回收效率。
6.8 将样品从磁力架上取出，加入30μl Nuclease-free ddH2O，使用移液器轻轻吹打充分混匀，室温静置2 min后置于磁力架上，待溶液澄清后（约5min），小心吸取28μl上清至一个新的Nuclease-free PCR管中。
洗脱产物可在-30～-15℃暂存一周。
6.9 Agilent 2100 Bioanalyzer 检测文库：取1μl纯化后的PCR产物用 Agilent DNA 1000 chip分析，由于2100迁移率的影响，最终文库的主峰分布可能存在约6-8bp偏差，如下图所示：miRNA文库的峰在143-147 bp处，piRNA文库的峰在153-156bp处。
注：A图和B图分别为1μg、100ng小鼠肝脏总RNA起始的Small RNA文库，147 bp处的主峰为miRNA；C图为1μg小鼠肾脏总RNA起始的Small RNA文库，147 bp处的主峰为miRNA，153 bp处的主峰为piRNA。
7.文库分选
根据6.9步骤中文库质控的结果选择文库分选纯化方式，如2100图显示120 bp处有较多接头二聚体、70-80 bp处有较多扩增引物残留以及160bp和190 bp处有明显的rRNA，则建议选择PAGE胶分离；如接头二聚体、扩增引物残留以及rRNA较少则可以选择磁珠进行文库分选。为确保最终有效文库的比例，建议使用PAGE胶进行文库分选。方案A：6％非变性PAGE胶分选文库
（1）将6％10孔非变性PAGE胶装置于电泳槽中，向其中加入适量1xTBE电泳缓冲液。
（2）向纯化的PCR产物中加入5μl6xLoading Buffer 混匀后离心收集至管底。
（3）取5μl pBR322／Mspl digest DNA Marker缓慢加入PAGE胶样孔中。
（4）将混有Loading Buffer的PCR产物缓慢加入PAGE胶样孔中，每个样品上两个样孔，每孔15μl。
（5）上样完成后，120-150V电压电泳约1h，不同的电泳装置电泳迁移速率可能不一致，所需电泳时间有差异，待样孔中的Loading Buffer蓝色指示剂全部跑出胶板后约3-5min方可停止电泳。
（6）将PAGE胶从电泳装置中取出，将PAGE胶从胶板上剥下。用Gel-red核酸染料染色10 min，在凝胶成像仪中进行观察，如下图所示，大约140bp和150 bp处的条带分别对应于miRNA文库和piRNA文库的条带。
（7）用刀片将对应的条带割下放于事先准备好的500μl低吸附EP管中（管底已用酒精灯烧过的1ml注射器针头戳了数个小洞），将500 μl EP管套到1.5ml低吸附EP管中，12,000 rpm（13,800xg）离心2min碾碎胶条。胶条的碾碎程度取决于500μl EP管底部小洞的孔径，所以只需使用注射器针头戳穿即可。
（8）离心完成后弃掉500μl EP管，向装有PAGE胶碎片的1.5ml EP管中加入250 μl GEBuffer，于50℃水浴锅中温育1-2h。
（9）将步骤8的EP管于离心机中12,000 rpm（13,800xg）离心2min，将蒸发到管壁的液体收集至管底。
（10）将步骤9的上清转移至离心过滤柱 Filtration Column中12,000 rpm（13,800xg）离心2 min 收集液体，弃去离心柱，将液体转移至新的1.5ml低吸附EP管中。
（11）向步骤10的上清中分别依次加入5μl Co-precipitator，30 μl 3M醋酸钠（pH 5.2）和1ml无水乙醇，振荡混匀后于-80℃沉淀1h。
（12）取出-80℃沉淀产物，于预冷至4℃的冷冻离心机中12,000 rpm（13,800xg），离心30 min。
（13）小心移除上清，注意切勿吸取到白色沉淀。向EP管中加入1ml新鲜配制的80％乙醇，于预冷至4℃的冷冻离心机中，12,000 rpm（13,800xg）离心10min。
（14）小心移除上清，注意切勿吸取到白色沉淀。短暂离心将管壁上残留的液体收集至管底，小心移除残留液体，室温开盖干燥约10min。
（15）待步骤14产物中残留的酒精全部挥发，加入15μl Nuclease-free ddH2O溶解沉淀。
（16）2100检测分选纯化的文库：取1μl分选纯化的产物用Agilent high sensitive chip分析，良好的文库应该如下图所示，对应的miRNA文库条带在147-149bp处。
方案B：双轮磁珠分选文库
（1）将VAHTS DNA Clean Beads提前30 min从2～8℃取出，静置使其温度平衡至室温。
（2）颠倒或涡旋振荡使VAHTS DNA Clean Beads充分混匀，取25μl纯化的PCR产物于200 μl PCR管中吸取32.5μl 磁珠（1.3x）加入到PCR产物中，使用移液器轻轻吹打10次充分混匀。
( 3）室温孵育5min，使DNA结合到磁珠上。
（4）将样品置于磁力架上，待溶液澄清后（约5min），小心移取上清至新的Nuclease-free PCR管中。
（5）向步骤4的产物中加入22.5μl磁珠（0.9x），使用移液器轻轻吹打10次充分混匀。（6）室温孵育5min，使DNA结合到磁珠上。
（7）将样品置于磁力架上，待溶液澄清后（约5min），小心弃去上清。
（8）保持样品始终处于磁力架上，加入200μl新鲜配制的80％乙醇漂洗磁珠，室温下孵育30sec，小心移除上清。
（9）重复步骤8一次。
（10）保持样品始终处于磁力架上，室温下开盖干燥磁珠约5min。加入80％乙醇时不要吹散磁珠；最后移除上清时需要使用10μl移液器将残留液体吸干净；应避免磁珠过分干燥（龟裂）而降低回收效率。
（11）将样品从磁力架上取出，加入17.5 μl Nuclease-free ddH2O，使用移液器轻轻吹10次打充分混匀，室温静置2 min后置于磁力架上，待溶液澄清后（约5min），小心吸取15μl上清至一个新的Nuclease-free PCR管中。
（12）2100检测分选纯化的文库：取1μl分选纯化的产物用Agilent DNA 1000 chip 或Agilent high sensitive chip分析，良好的文库应该如图所示，对应的miRNA文库条带在147-149 bp处。
四、Small RNA建库的常见FAQ
RT primer 能否在cDNA合成步骤添加？
不能。3'接头连接完成后加入的RT primer与多余3'接头反向互补形成双链结构，可以有效阻止5'接头与3'接头连接，从而减少接头二聚体的形成；另外，RT primer与已连上3'接头的RNA底物方向互补可作为逆转录步骤的引物，因此RT primer必须在3'接头连接完成之后添加。
·除常规的动植物总RNA外，其他类型的总RNA是否可以作为起始模板进行文库构建？
除动、植物总RNA以及分离纯化的Small RNA外，Vazyme ＃NR811可以兼容其他类型的总RNA，比如外泌体总RNA作为起始模板。下图为以HeLa细胞培养物上清的外泌体总RNA为模板构建的miRNA文库（起始模板投入80ng）。
安培生物致力成为推动生命科学进步值得信赖的合作者
深圳/湛江安培生物科技有限公司,是一家具有核心的技术实力、先进的经营管理水平和完善的市场销售体系的生物高科技企业。总部设在广东，服务面向全国。安培生物集进口试剂、实验室耗材销售、技术服务与合约开发为一体的专业化高科技公司，旨在为生命科学的发展提供较好的产品与服务。本公司建立了涵盖分子生物学、细胞生物学、免疫学、信号传导和神经科学等领域的产品供应线，在各个领域内向用户提供较高的水平和质量稳定的产品，安培生物致力于为广大的科研机构、高等院校等客户提供各种产品、技术支持与服务。
可以在第一时间为用户提供比较先进的专业资讯和完备的产品和物流服务。 专业的技术力量使得我们能够为广大用户提供强大的技术支持，深厚的人脉资源使得我们在全国主要城市拥有众多的合作伙伴，安培生物非常荣幸能将世界上先进的高科技产品推荐给国内从事生物学领域科研的老师和同仁。作为专业性的产品供应商，公司出资存备了大量现货，配合优秀的销售队伍以及专业的技术支持，随时为客户提供服务。
