qpcr结果和wb结果不一致？为什么呢-化工仪器网-手机版

qpcr结果和wb结果不一致？是什么原因呢？今天让我们来探讨一下~

一、实验技术层面的原因

(1) 样品制备与处理

在qPCR中，如果总RNA样品提取环节出现失误，如取材到液氮速冻耗时过长导致RNA降解，或在制样时没有保持低温环境、没有有效防范外源性RNA酶的污染，都可能影响RNA的质量和qPCR结果的准确性。

在WB实验中，蛋白样品制备环节同样至关重要。如果取材到液氮速冻耗时过长或制样时没有保持低温环境，可能导致蛋白降解。此外，如果没有加蛋白酶抑制剂，也可能导致蛋白降解。另外，如果蛋白发生可逆性沉淀，如低温保存时蛋白浓度高导致沉淀，或pH值过低导致蛋白沉淀，也会影响WB结果的准确性。

(2) 实验操作的精确性

在进行qPCR时，如果引物设计策略有误、引物形成二聚体、熔合曲线呈现双峰，或引物实际扩增效率未检测而默认为100%计算，都可能导致结果不准确。

在WB实验中，如果电泳、转膜、抗体孵育、发光成像等环节出现失误，如电泳电压不稳定、转膜不wanquan、抗体浓度不合适、曝光时间不当等，也会影响结果的准确性。

二、生物学层面的原因

(1) 翻译后调控或修饰

有时蛋白的mRNA水平可能保持不变，但经过翻译过程后蛋白的产量显著增加。因此，即使mRNA水平没有变化，也可能出现蛋白水平升高的情况。相反，如果存在一些影响翻译过程的因素，也可能导致mRNA水平高而蛋白水平低的情况。

同时，蛋白质在合成后可能会经历各种翻译后调控或修饰过程，如磷酸化、糖基化、泛素化等。这些修饰过程可能影响蛋白质的稳定性、活性或定位，从而导致WB结果与qPCR结果不一致。

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(2) 延迟效应

蛋白质合成需要耗费时间，而mRNA表达则能迅速响应外界刺激。因此，在某些情况下，mRNA的变动可能比蛋白质水平的变化来得早或晚，导致两者之间的结果不一致的情况。

(3) mRNA剪接多变数

转录后的mRNA可能产生多种剪接体。而qPCR往往只针对其中一段进行扩增和检测。因此，即使检测到的mRNA水平下降了，其他剪接体可能正在增加，导致蛋白质水平反而上升，这种现象需要我们特别留意。

(4) 蛋白翻译后的稳定性

蛋白在翻译后可能会经历各种修饰，这些修饰可能会影响蛋白的稳定性。举例来说，增加泛素化修饰可能会促进蛋白通过蛋白酶体途径进行降解，从而导致蛋白水平下降。

(5) 负反馈机制调节

细胞内存在负反馈机制来调节mRNA和蛋白质的水平。有时蛋白的mRNA水平可能保持不变，但经过翻译过程后蛋白的产量显著增加。因此，即使mRNA水平没有变化，也可能出现蛋白水平升高的情况。相反，如果存在一些影响翻译过程的因素，也可能导致mRNA水平高而蛋白水平低的情况。这种动态平衡机制可能导致mRNA和蛋白质水平在不同时间点出现不一致。