CRISPR/Cas系统是细菌获得性免疫的重要组成部分，由Cas核酸酶和两种单独的RNA成分组成，即可编程crRNA（CRISPR RNA）和固定的TracRNA（反式激活crRNA）。
2012年，Jennifer Doudna和Emmanuelle Charpentier发现Cas9可以当作DNA切割工具，CRISPR/Cas9技术才真正开始受到广泛关注。
CRISPR/Cas9调控机制
1、CRISPR的转录：CRISPR被转录成一条长RNA(pre-crRNA)，包含了重复序列和间隔序列。
2、tracrRNA的转录：tracrRNA转录成tracrRNA。
3、CRISPR/Cas9复合物的成熟：tracrRNA与pre-crRNA结合，经过外源RNase III的剪切，Cas9也参与crRNA成熟。tracrRNA与crRNA融合即sgRNA，并与Cas9结合。
4、靶标识别：CRISPR/Cas9复合物扫描入侵的DNA，寻找与crRNA间隔序列互补的序列。识别过程中，crRNA的间隔序列与目标DNA（即gRNA）的特定序列（原间隔短回文重复序列邻近基序，PAM）配对。
5、DNA切割：一旦找到匹配的序列，核酸酶Cas9就在PAM位点附近切割DNA双链。核酸酶Cas9有两个核酸酶结构域，HNH结构域切割DNA的一条链，RuvC结构域切割另一条链。
6、DNA修复：细菌或细胞通过非同源末端连接(NHEJ)或同源定向修复(HDR)机制修复DNA断裂。NHEJ通常会导致插入或缺失(indels)，而HDR可以精确修复DNA，如果提供了修复模板的话。
注：CRISPR/Cas9系统的调控：在自然状态下，CRISPR/Cas9系统的激活是被动的，一旦crRNA与Cas9结合，系统就处于待激活状态。可以通过设计特定的gRNA来调控CRISPR/Cas9系统，使其靶向特定的基因序列。
图1 CRISPR/Cas9调控[1]
图2 CRISPR/Cas9剪切后的DNA修复[1]
CRISPR/Cas9的基因调控
CRISPR/Cas-9介导的基因组编辑已成为治疗开发和生物医学研究中一项潜在的创新技术。CRISPR/Cas9技术由于其灵活性、简单性、高效性和精确基因组编辑的多重性而为疾病治疗带来了巨大的希望。
1、GM-CSF：CRISPR/Cas9介导的GM-CSF敲除，并与野生型CAR T细胞相比，GM-CSFk/oCAR T细胞产生较少的GM-CSF而不减弱体内抗肿瘤活性[2]。
图3 A: 在野生型CART19和GM-CSFk/o CART19上具有相似CAR表达的成功CAR-T细胞生产。
B: 通过细胞内染色检测，在用CD19阳性ALL细胞系NALM6刺激时，与野生型CART19相比，GM-CSFk/o CART19细胞显示出减少的GM-CSF
2、Frizzled 7：在脑内出血(ICH)诱导前48h，通过脑室内注射成簇规则间隔回文重复序列(CRISPR)进行Frizzled 7激活或敲低。结果表明激活Frizzled-7可显著增加Dvl、β-Catenin、WISP1、VE-Cadherin、Claudin-5、ZO-1的表达，并降低磷酸-β-Catenin的表达。在ICH后24h，WISP1基因敲除可消除Frizzled 7激活对VE-Cadherin、Claudin-5和ZO-1表达的影响。因此，Frizzled 7可能是ICH患者BBB保护和改善预后的潜在治疗靶点[3]。
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参考文献：
[1] Jiang F, Doudna JA. CRISPR-Cas9 Structures and Mechanisms. Annu Rev Biophys. 2017 May 22;46:505-529. doi: 10.1146/annurev-biophys-062215-010822. Epub 2017 Mar 30. PMID: 28375731.
[2] Sterner RM, Cox MJ, Sakemura R, Kenderian SS. Using CRISPR/Cas9 to Knock Out GM-CSF in CAR-T Cells. J Vis Exp. 2019 Jul 22;(149). doi: 10.3791/59629. PMID: 31380838.
[3] He W, Lu Q, Sherchan P, Huang L, Hu X, Zhang JH, Dai H, Tang J. Activation of Frizzled-7 attenuates blood-brain barrier disruption through Dvl/β-catenin/WISP1 signaling pathway after intracerebral hemorrhage in mice. Fluids Barriers CNS. 2021 Sep 26;18(1):44. doi: 10.1186/s12987-021-00278-9. PMID: 34565396.
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