原子力显微镜在角膜基质细胞形态中的研究应用

角膜的主要结构为角膜基质层，占整个角膜厚的90％左右，在维持角膜高透明度和人眼正常视觉功能方面发挥着重要作用。人类角膜基质细胞是角膜基质中的主要细胞类型。它们在细胞外基质的分泌和组装以维持角膜基质结构的高度排列以及角膜基质创面修复中都发挥着不可替代的关键作用。人类角膜基质细胞在受到机械创伤、病原体感染或药物中毒的刺激后，会死亡或发生表型转化，导致角膜水肿，严重的情况下，角膜会变得浑浊甚至失明。因此，探究人类角膜基质 细胞的结构和生物力学特性显得尤为重要。

细胞的生物功能高度依赖于它与基底的相互作用。培养细胞时所用的基底不同， 细胞的形态和力学特性也会有所差异， 探索细胞-底物相互作用和细胞对力刺激的反应正日益成为细胞研究领域的一个重要课题，例如细胞粘附、变形、定向迁移、凋亡等。原子力显微镜（AFM）能够在纳米尺度上提取软生物样品的结构信息。此外， AFM可以通过测量角膜基质细胞表面的模量和捕捉形态学来确定离散的角膜层的局部机械性能。利用AFM的进展,如峰值力定量纳米机械原子力显微镜,可以快速获取样品的力学性能。

天津理工大学天津市机电系统设计与智能控制重点实验室王鑫老师团队^[1]通过探究角膜基质细胞-底物之间的相互作用对细胞形态及力学特性的影响。将角膜基质细胞分别培养在三种不同硬度的基底上，三种基底分别为空白普通培养皿（硬基底）， 2D胶原上（鼠尾Ⅰ型胶 原蛋白包被的培养皿）， 3D胶原上（三维鼠尾Ⅰ型胶原蛋白的培养皿）， 通过布鲁克生物型原子力显微镜（Bioscope）表征角膜基质细胞的形貌，并且利用AFM力曲线阵列模式获得角膜基质细胞上选定区域的力-位移曲线， 通过模型拟合力-位移曲线获得相应的弹性模量， 以此探究角膜基质细胞在不同基底上的力学特性。将角膜基质细胞置于细胞培养液中且保证液体温度在37℃左右。待温度稳定后，再进行样本扫描，使用的AFM工作模式为Peak Force QNM in Fluid，得到角膜基质细胞的形貌图，再利用AFM的force volume模式对已测得的细胞形貌区域内做力-位移曲线。将细胞压痕保持在弹性范围内。角膜基质细胞上所测得的典型力-位移曲线如图1。

图1.角膜基质细胞的单个力－位移曲线

在实验过程中，通过测得的力-位移曲线，蓝色曲线表示探针压入细胞的过程，称其为加载曲线，红色曲线表示探针离开细胞表面的过程，称其为卸载曲线。已知的量有探针对细胞施加的载荷Ｆ，针尖压入细胞表面的深度δ，针尖半径Ｒ，细胞的泊松比ν，通过曲线拟合就可以得到细胞表面的弹性模量值。

利用AFM采集到的三种不同基底上的角膜基质 细胞形貌如图2所示。将采集到的细胞形貌图像利用AFM离线分析后再经过软件进行后处理分析，对图像进行压平处理，得到最后的角膜基质细胞的AFM形貌图。

图2.角膜基质细胞的AFM形貌图

从图2看出角膜基质细胞形态总体呈梭形形状，而长在硬基底 图2a上的角膜基质细胞形态呈梭形较长，且铺展面积较小，在３Ｄ胶原图2b上生长的角膜细胞生长形状和铺展面积均适中，而在２Ｄ胶原 图2c 上的角膜细胞形态逐渐由梭形变为类似三角的形状且铺展面积也变大。

AFM 具有纳米级的成像分辨率，可以在近生理条件下对细胞进行高分辨形貌成像和力学性能测量，利用AFM技术获得不同硬度的培养基底上角膜基质细胞的形貌图和角膜基质细胞的弹性信息，并对实验结果数据进行分析。角膜基质细胞培养在不同硬度的基底上的形貌有所差别，培养在越软的基底上，角膜基质细胞的形状由在硬基底上的梭形逐渐变化为类似三角形状，且铺展面积变大。

原子力显微镜近年来成为研究细胞形貌和力学特性的一种新兴的工具，在生物材料方面具有准确的活细胞定量力学性质成像、高分辨率的生物分子和细胞成像、动态生物过程的快速扫描等优势，将获取生物样品中的物理结构、生化相互作用过程和力学性能信息变成可能。

◆ 使用电容传感器技术的探针扫描方式

◆ PeakForce Tapping和QI模式，适用于针对精细样品的高分辨率成像与高级力控制