每一个Western blot都涉及到抗原和抗体的相互作用，因此，抗体浓度并不是一成不变的，优化很重要。一抗和二抗浓度取决于每个抗体的特异性和抗原的特异性，以及样品中存在的抗原量。每个厂家提供的二抗特异性也不同。在改变实验参数，如更换了抗原、一抗、二抗或底物时，有必要重新优化。
也许你要问，什么情况下需要优化抗原/抗体浓度呢？若Western blot出现了以下的结果，则你有必要找找原因，优化一下抗原/抗体的浓度。
1，信号弱 2， 信号迅速地减弱 3，无信号，无背景
4， 高背景，白色条带 5， 膜上出现橙色或棕色的点 6， 非特异性条带
7，弥散条带 8， 斑点状背景
若是利用不同浓度的抗原或抗体，开展多次Western blot，也未尝不可，但这也太耗时了。折腾两下，一个星期就过去了。
简便快速的斑点印迹步骤，你要准备的材料：
• 硝酸纤维素膜，剪成1 cm×8 cm的长条
• 包含抗原的样品，以PBS、TBS或类似缓冲液稀释
• 一抗和HRP结合的二抗
• 封闭液
• 洗涤液
• 底物工作液：HRP的化学发光底物（如SuperSignal底物）
• 胶片或CCD成像系统
操作步骤 ：
1. 用TBS或PBS制备蛋白样品的稀释液。稀释度要取决于样品中存在的抗原浓度。由于抗原浓度通常未知，因此有必要检测宽范围的稀释度。SuperSignal底物有着皮克至飞克水平的检测灵敏度。因此样品稀释可以在微克至飞克范围。
2. 制备硝酸纤维素膜，用铅笔标上每个待测一抗/二抗的浓度。所需转印膜的数量取决于待筛查的一抗和/或二抗有多少种不同的稀释浓度。通常来说，一抗要检测一到两个稀释度，而二抗要检测两到三个稀释度。例如：使用SuperSignal底物，一抗和二抗可如下稀释： 1/1000的一抗和1/50000的二抗
1/1000的一抗和1/100000的二抗
1/5000的一抗和1/50000的二抗
1/5000的一抗和1/100000的二抗
3. 将硝酸纤维素膜放在滤纸上。将抗原稀释液点在膜上。每个点的体积越少越好（1-5μl），以保证点尽可能地小。如果需要使用5μl以上的样品，在点完一次后，干燥2-5分钟，再点一次。让膜干燥10-15分钟，或直至无可见水分。
4. 用封闭液封闭膜上的非特异性位点，室温震荡孵育1 h。
5. 用包含1/10体积封闭液的洗涤液稀释一抗，并加到膜上，室温震荡孵育1h。
6. 用洗涤液洗膜4次，每次5分钟，用尽可能大体积的洗脱液。
7. 用包含1/10体积封闭液的洗涤液稀释二抗，并加到膜上，室温震荡孵育1h。
8. 用洗涤液洗膜4次，每次5分钟，用尽可能大体积的洗脱液。
9. 准备底物工作液，将等体积的SuperSignal Substrate Luminol/Enhancer溶液与过氧化物溶液混合。制备足够体积的工作液，以确保印迹点*湿润，且印迹点在孵育过程中不会干。建议体积：0.125 ml/cm2印迹。
10. 将膜放在底物工作液中孵育5分钟。
11. 将膜取出，放在塑料布或其它防护膜上。
12. 蛋白一侧朝上，将印迹贴到胶片上，曝光30-60秒。为获得*结果，曝光时间可能不同。如果*次曝光不够，再试试2-5分钟。另外，也可用CCD相机或其它成像仪。
13. 在一张优化好的印迹膜上，底物产生的信号可能会持续6-24小时，这取决于具体的产品。若结果不佳，可重新曝光。随印迹时间的延长，可能需延长曝光时间。如果仍未获得*结果，可用不同浓度的抗原和/或抗体重复以上步骤。
