抗原致敏IL-12基因修饰的树突状细胞诱导抗肾癌免疫的体外研究

【摘要】  【目的】 探讨肾癌细胞抗原致敏白介素-12（IL-12）基因修饰的树突状细胞（DC）体外诱导、激活细胞毒性T淋巴细胞（CTL）免疫杀伤肾癌细胞的效能及相关免疫机制。【方法】采用重组逆转录病毒介导IL-12基因修饰人外周血单个核细胞（PBMC）来源的DC；超声细胞破碎法提取肾癌细胞粗提抗原（Ag）致敏经IL-12转染的DC；ELISA法检测各组DCs和各组CTLs上清中IL-12、IFN-γ因子的分泌水平；流式细胞仪（FACS）分析各组DCs表面CD83 、CD86、HLA-DR的表达； MTT法检测DC刺激同源T淋巴细胞增殖的能力及CTL免疫杀伤肾癌细胞的效能；统计学分析比较各组间的差异。【结果】经IL-12基因修饰和抗原致敏后的DC高表达CD83 和CD86分子分别为（65.9%±3.1%, 92.8%±3.4%），分泌高水平IL-12 （279.6 ±1.7）pg/mL及IFN-γ （892 ±31）pg/mL，刺激同源T淋巴细胞增殖明显，诱导激活的CTL上清中IFN-γ水平（1146±31）pg/mL显著高于对照组；CTL对肾癌细胞有强大的杀伤作用，显著高于各对照组。【结论】 经IL-12基因修饰和抗原致敏后的DC能有效地诱导CTL特异性抗肿瘤免疫应答。其机制可能与IL-12基因修饰和抗原致敏活化了DC抗原提呈第二信号，促进了DC高分泌IL-12因子，激活了T淋巴细胞致使CTL分泌IFN-γ的能力增强密切相关。

【关键词】  肾细胞癌； 肿瘤抗原； 白细胞介素-12； 树突状细胞； 肿瘤疫苗

树突状细胞（dendritic cell, DC）是体内功能zui强的抗原提呈细胞，它能直接诱导、增殖、活化T淋巴细胞，产生特异性免疫应答[1]，在启动抗肿瘤免疫反应中起关键作用[2]。研究表明癌组织中DC的数量是肿瘤预后的重要参数之一[3]，研究也发现荷瘤宿主体内存在一定数量的DC，但DC的数量、形态、表型异常，免疫能力差[4]。因此，构建一种以DC为基础的瘤苗，对DC进行一定的修饰，籍以增强DC的免疫功能将能增强肿瘤患者的免疫功能。本研究采用786-0肾癌细胞株粗提抗原致敏和IL-12基因转染DC，制备成DC瘤苗，观察其体外诱导自体T淋巴细胞产生特异性抗肾癌免疫的效能，并对结果进行分析。

    1   材料与方法

    1.1   材料

    1.1.1   主要试剂   RPMI-1640购自Gibco公司；特优级胎牛血清（FBS）购自Hyclone公司；重组人粒细胞-巨噬细胞集落群体刺激因子（rhGM-CSF）, 重组人白细胞介素-4（rhIL-4），重组人白细胞介素-2（rhIL-2）购自Peprotech公司；人IL-12ｐ70和IFN-γ ELISA检测试剂盒购自晶美公司；FITC标记的鼠抗人HLA-DR、CD83 、CD86抗体均为PharMingen及caltag公司产品；淋巴细胞分离液（Ficoll-Hypaque）为上海试剂二厂；流式细胞仪为美国BECKMAN-COULTER（贝克曼-库尔特）公司产品；酶标仪为荷兰MULTISKAN MK3公司产品；超声细胞破碎仪为美国SONICS&MATEIALS公司产品。

    1.1.2   病毒载体和细胞系   PA317-IL-12重组逆转录病毒由北京大学深圳医院李宝金博士后惠赠，其病毒滴度为1.1×105～1.4×105 CFU/mL；786-0肾癌细胞株购自上海*细胞库。

    1.2   实验分组设计

    1.2.1   DC分组   ①实验组：抗原致敏IL-12基因修饰DC 组（DCIL-12+Ag）；②对照组：抗原致敏DC组 （DCAg）；③对照组：IL-12基因修饰DC组 （DCIL-12）；④DC对照组（DCnaive）。各组样本数均为6。

    1.2.2   CTL分组   ①实验组：抗原致敏IL-12基因修饰DC刺激组 （CTLDC-IL-12+Ag）； ②对照组： 抗原致敏DC刺激组 （CTLDC+Ag）；③对照组： IL-12基因修饰DC刺激组 （CTLDC-IL-12）；④对照组： DC刺激组 （CTLDC-naive）； ⑤T细胞对照组（Tnaive）。各组样本数均为6。

    1.3   方法

    1.3.1   树突状细胞的体外诱导和培养   外周血来自临床血库新鲜全血300 mL，每次取50 mL，用淋巴细胞分离液分离，收集单个核细胞（PBMC），用无钙镁PBS液（pH 7.2）洗2～3遍，调整细胞浓度为106 cells /mL，接种在两6孔板上贴壁，每孔加2 mL，4 h后吸去悬浮的淋巴细胞（冻存备后用），留下贴壁细胞 （DC前体细胞）加入含GM-CSF（1000 U/mL）、IL-4（500 u/mL）和10% FBS的RPMI-1640*培养液，在37 ℃、5% CO2孵箱中培养，每2 d～3 d更换培养液，培养7 d～9 d收集DC和上清。

    1.3.2   树突状细胞的表型检测   收集DC并计数，按分组设计，每管细胞数约105个细胞，采用流式细胞仪检测DC表面CD83 、CD86 、HLA-DR的表达。

    1.3.3   肿瘤抗原的制备   常规培养并收集786-0肾癌细胞，显微镜下计数，根据细胞数的多少按106 /mL比率用PBS重悬，用超声细胞破碎仪30%强度 （输出功率为20 kHz） 破碎细胞4～5 min，离心收集上清即为肿瘤粗提抗原，过滤除菌，-80 ℃保存备用。

    1.3.4   树突状细胞的转染和致敏   DC培养至第6天，按DC分组设计，用PA317-IL-12 （MOI 100）常规对DC转染4 h，PBS液洗涤去除游离病毒后重悬，经IL-12基因转染过的DC（DC-IL-12）在上述条件*培养液中继续培养，同时加入786-0肾癌细胞抗原悬液 （抗原细胞∶DC约为10 ∶ 1） 混合培养致敏DC 72 h （为减少实验误差，未转染组在第4天时也弃上清重悬）。于转染后第3天收集各组DC培养上清，ELISA法检测上清中IL-12、IFN-γ的分泌水平；收集的DC计数用于诱导、刺激T淋巴细胞增殖实验和进行流式细胞检测。

    1.3.5   树突状细胞诱导自体T淋巴细胞增殖与活化   复苏前述冻存的淋巴细胞，尼龙毛柱法分离纯化，获得T淋巴细胞，按分组设计，按DC ∶ 淋巴细胞=1 ∶ 10比例，将DC和淋巴细胞在含IL-2 （200 U/mL）、10% FBS的RPMI-1640培养液中，37 ℃、5% CO2条件下混合培养，每2～3 d加入少量更高浓度IL-2因子的培养液，不更换原培养液以免丢失细胞，第6天收集各组细胞（CTL）和培养上清，ELISA检测上清中IL-12、IFN-γ因子的分泌水平；MTT法测定各组淋巴细胞增殖情况，按公式计算刺激指数（SI）。SI＝ [（反应组A值－淋巴细胞组A值－DCs组A值）/ 淋巴细胞组A值 ]；对照组T淋巴细胞增殖指数＝ [（淋巴细胞组A值－增殖前淋巴细胞组A值）/ 增殖前淋巴细胞组A值]。

    1.3.6   细胞毒实验   以5组CTL为效应细胞，786-0肾癌细胞为靶细胞，效靶比均设计为50∶1，25∶1和10∶1进行细胞毒实验，MTT法测定细胞毒性，计算杀伤率。效应细胞对靶细胞的杀伤率＝[（靶细胞A值+相应效应细胞A值－效靶混合细胞A值）/靶细胞A值 ] ×100 %

    1.4   统计学分析

    所有变量均表示为表示，采用SPSS11.0软件包，各组之间比较用单因素方差分析（ONEWAY ANOVA），各组间比较用zui小差异法（LSD），与实验组比较用DUNNETT法比较，以双侧P< 0.05为有统计学意义。

    2   结   果

    2.1   DC体外培养和表型检测

    每50 mL外周血收集到的PBMC经rhGM-CSF与rhIL-4细胞因子体外共培养7 d后，DC呈集落增殖，由2.5×105增至约2.0×106，倒置显微镜下可观察到细胞有大量的星状、树枝状突起，细胞形态大小不一，为悬浮生长，具有典型的DC特征。未经任何处理的DC第7天仍处于非成熟状态，CD83表达低（10.0%±1.1%），经IL-12基因修饰和/或抗原致敏后的DC第7天表现成熟，抗原提呈能力增强，其表面的成熟标志分子CD83及共刺激分子CD86高表达，其中以DCIL-12+Ag组zui高（分别为65.9%±3.1% 和92.8%±3.4%），CD83、CD86各组间比较具有统计学差异（表1）。

    2.2   抗原致敏和IL-12基因修饰促进DC分泌IL-12、IFN-γ

    ELISA检测结果显示，按1×106 DCs /mL计算，经IL-12基因修饰、抗原致敏后的DC能高分泌IL-12和IFN-γ因子，其中以DCIL-12+Ag组zui高，各组间比较具有统计学差异，P < 0.01 （表2）。

    2.3   抗原致敏和IL-12基因修饰的DC诱导、促进T淋巴细胞增殖

    经抗原致敏和IL-12基因修饰的DC明显诱导、促进T淋巴细胞增殖，以DCIL-12+Ag组zui显著，T淋巴细胞增殖刺激指数为9.88，未经刺激的T淋巴细胞在IL-2培养条件下也能少量增殖，增殖指数为1.16，组间比较差异有统计学意义（表3）。

    2.4   抗原致敏和IL-12基因修饰的DC促进CTL分泌IFN-γ，DC继续分泌IL-12

    ELISA检测结果显示，经IL-12基因修饰、抗原致敏后的DC能有效地诱导T淋巴细胞活化，促进CTL分泌高水平的IFN-γ因子，DC瘤苗仍继续高分泌IL-12因子，其中以实验组zui高，分别为（1 146±31）pg/mL和（215±25）pg/mL，与其他组比较具有统计学差异（表4）。

    2.5   细胞毒实验

    经转染、致敏后的DC能诱导CTL对肾癌细胞发挥强烈的杀伤作用，杀伤率随效靶比的升高而增强，其中以DCIL-12+Ag组zui强； DCnaive组也表现有一定的杀伤作用，而且比单纯T细胞对照组强，可能是DC在体外未受到肿瘤环境的长期抑制作用；T细胞对照组在效靶比高时也表现有一定的杀伤力，可能为非特异性免疫杀伤作用（表5）。

    3   讨   论

    DC是人体内zui重要的专职抗原提呈细胞，在启动抗肿瘤免疫反应中起关键作用[2，5]。以DC为基础的各种形式的DC多价瘤苗已经广泛研究[6-9]，并取得了初步成效。白细胞介素 12（IL-12）由p35（IL-12A）及p40（IL-12B）两条多肽链组成，是一种重要的细胞因子，有明显的抗肿瘤免疫作用，主要由DC、Mφ等抗原提呈细胞分泌产生，具有激活NK细胞、促进T细胞增殖分化、促进CD40+TH0细胞分化为TH1细胞，可诱导静息的和激活的T淋巴细胞产生IFN-γ，促进IFN-γ、IFN-α和IL-2合成，同时可上调CD80、CD86等多种共刺激分子的表达，从而增强DC提呈抗原能力，诱导CTL产生特异性免疫应答[10-12]。

    本研究以786-0肾癌细胞株肿瘤抗原体外致敏IL-12基因修饰的DC，制备成DC疫苗，观察到其能诱导CTL特异性杀伤786-0细胞效能显著，明显强于对照组。实验结果显示DCIL-12+Ag组DC高表达成熟分子标记CD83和共刺激分子CD86，提示DC提呈抗原能力增强；DCIL-12+Ag组上清中IL-12、IFN-γ水平高于对照组，而IL-12对CD4+T细胞、NK细胞有促进作用，这也解释了实验中DCIL-12+Ag组和DCIL-12组对T淋巴细胞的增殖作用强于其他组，这种DC-IL-12+Ag瘤苗持续分泌IL-12，IL-12持续刺激T细胞增殖、活化，发挥强大的抗肿瘤免疫。综合其免疫机制可能是DC-IL-12+Ag瘤苗综合了对照组DCIL-12、DCAg疫苗的优点，又保持了DC本身的特点，即在增强了抗原提呈能力，增强了诱导激活CTL发挥特异性抗肿瘤细胞免疫，同时又持续高分泌IL-12、IFN-γ因子发挥非特异性抗肿瘤体液免疫，从而起到协同抗肿瘤作用。另外，在荷瘤宿主中，肿瘤细胞能释放一些免疫抑制因子，如转化生长因子（TGF）、血管内皮生长因（VEGF）和白细胞介素4（IL-4），可降低DC细胞表面的MHC分子和共刺激分子B7的表达，使其分泌IL-12能力下降，从而不能有效激活T细胞杀伤肿瘤细胞[13]。也有研究发现，肿瘤细胞不仅可以诱导DC细胞凋亡，而且可以抑制DC细胞产生和成熟，导致肿瘤微环境中DC缺失功能表达[4]。为此，有针对性地改变DC所处肿瘤微环境相关细胞因子的浓度，可以提高DC抗原呈递和抗肿瘤免疫效应。DC-IL-12+Ag瘤苗因能持续高分泌IL-12因子，从而可以解除宿主因肿瘤释放的IL-10、IL-4、VEGF等多种因子对DC功能的抑制作用，这为DC-IL-12+Ag瘤苗回输体内发挥抗肿瘤作用提供了理论依据。

    临床上肾癌的表现具有隐蔽性，出现“三联征”大部分已是晚期[14]，晚期肾癌*术并不能达到*的目的。肾癌对放疗和化疗均不敏感，由于肾癌是一种免疫原性很强的肿瘤，所以对晚期肾癌的治疗上免疫治疗有其*的优势，这为DC疫苗开辟了前景。本研究虽为体外实验，但为进一步深入临床应用，探索肾癌的免疫治疗提供了重要的依据。