上海抚生科技发展有限公司
2012/9/17 9:51:19人核转录因子κB-P65ELISA 检测试剂盒
本试剂仅供研究使用 标本：血清或血浆
试验原理：
NF-κB-P65试剂盒是固相夹心法酶联免疫吸附实验（ELISA）.已知NF-κB-P65浓度的标准品、未知浓度的样品加入微孔酶标板内进行检测。先将NF-κB-P65和生物素标记的抗体同时温育。洗涤后，加入亲和素标记过的HRP。再经过温育和洗涤，去除未结合的酶结合物，然后加入底物A、B，和酶结合物同时作用。产生颜色。颜色的深浅和样品中NF-κB-P65的浓度呈比例关系。
试剂盒内容及其配制
试剂盒成份（2-8℃保存） 96孔配置 48孔配置 配制
96/48人份酶标板 1块板（96T） 半块板（48T） 即用型
塑料膜板盖 1块 半块 即用型
标准品：8.0umol/L 1瓶（0.6ml） 1瓶（0.3ml） 按说明书进行稀稀
空白对照 1瓶（1.0ml） 1瓶（0.5ml） 即用型
标准品稀释缓冲液 1瓶（5ml） 1瓶（2.5ml） 即用型
生物素标记的抗NF-κB-P65抗体 1瓶（6ml） 1瓶（3.0ml） 即用型
亲和链酶素-HRP 1瓶（10ml） 1瓶（5.0ml） 即用型
洗涤缓冲液 1瓶（20ml） 1瓶（10ml） 按说明书进行稀释
底物A 1瓶（6.0ml） 1瓶（3.0ml） 即用型
底物B 1瓶（6.0ml） 1瓶（3.0ml） 即用型
终止液 1瓶（6.0ml） 1瓶（3.0ml） 即用型
标本稀释液 1瓶（12ml） 1瓶（6.0ml） 即用型
人核转录因子κB-P65ELISA 检测试剂盒自备材料
1． 蒸馏水。
2． 加样器：5ul、10ul、50ul、100ul、200、500ul、1000ul。
3． 振荡器及磁力搅拌器等。
安全性
1． 避免直接接触终止液和底物A、B。一旦接触到这些液体，请尽快用水冲洗。
2． 实验中不要吃喝、抽烟或使用化妆品。
3． 不要用嘴吸取试剂盒里的任何成份。
操作注意事项
1． 试剂应按标签说明书储存，使用前恢复到室温。稀稀过后的标准品应丢弃，不可保存。
2． 实验中不用的板条应立即放回包装袋中，密封保存，以免变质。
3． 不用的其它试剂应包装好或盖好。不同批号的试剂不要混用。保质前使用。
4． 使用一次性的吸头以免交叉污染，吸取终止液和底物A、B液时，避免使用带金属部分的加样器。
5． 使用干净的塑料容器配置洗涤液。使用前充分混匀试剂盒里的各种成份及样品。
6． 洗涤酶标板时应充分拍干，不要将吸水纸直接放入酶标反应孔中吸水。
7． 底物A应挥发，避免长时间打开盖子。底物B对光敏感，避免长时间暴露于光下。避免用手接触，有毒。实验完成后应立即读取OD值。
8． 加入试剂的顺序应一致，以保证所有反应板孔温育的时间一样。
9． 按照说明书中标明的时间、加液的量及顺序进行温育操作。
样品收集、处理及保存方法
1、 血清-----操作过程中避免任何细胞刺激。使用不含热原和内毒素的试管。收集血液后，1000×g离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。
2、 血浆-----EDTA、柠檬酸盐、肝素血浆可用于检测。1000×g离心30分钟去除颗粒。
3、 细胞上清液---1000×g离心10分钟去除颗粒和聚合物。
4、 组织匀浆-----将组织加入适量生理盐水捣碎。1000×g离心10分钟，取上清液
5、 保存------如果样品不立即使用，应将其分成小部分-70 ℃保存，避免反复冷冻。尽可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量颗粒，检测前先离心或过滤。不要在37℃或更高的温度加热解冻。应在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。
试剂的准备
1． 标准品：标准品的系列稀释应在实验时准备，不能储存。稀释前将标准品振荡混匀。稀释比例按下表中进行：
8.0 umol/L （6号标准品） 原倍浓度不用稀释直接加入50ul。
4.0 umol/L （5号标准品） 100ul的原倍标准品加入100ul的标准品稀释液
2.0 umol/L （4号标准品） 100ul的5号标准品加入100ul的标准品稀释液
1.0 umol/L （3号标准品） 100ul的4号标准品加入100ul的标准品稀释液
0.5 umol/L （2号标准品） 100ul的3号标准品加入100ul的标准品稀释液
0.25 umol/L （1号标准品） 100ul的2号标准品加入100ul的标准品稀释液
0 umol/L （空白对照） 原始浓度不用稀释直接加入50ul。
2． 洗涤缓冲液（50×）的稀释：蒸馏水50倍稀释。
操作步骤
1． 使用前，将所有试剂充分混匀。不要使液体产生大量的泡沫，以免加样时加入大量的气泡，产生加样上的误差。
2． 根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数。每个标准品和空白孔建议做复孔。每个样品根据自己的数量来定，能使用复孔的尽量做复孔。标本用标本稀释液1：1稀释后加入50ul于反应孔内。
3． 加入稀释好后的标准品50ul于反应孔、加入待测样品50ul于反应孔内。立即加入50ul的生物素标记的抗体。盖上膜板，轻轻振荡混匀，37℃温育1小时。
4． 甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。
5． 每孔加入80ul的亲和链酶素-HRP，轻轻振荡混匀，37℃温育30分钟。
6． 甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。
7． 每孔加入底物A、B各50ul，轻轻振荡混匀，37℃温育10分钟。避免光照。
8． 取出酶标板，迅速加入50ul终止液，加入终止液后应立即测定结果。
9． 在450nm波长处测定各孔的OD值。
人核转录因子κB-P65ELISA 检测试剂盒建议使用的实验方案
标准品浓度（umol/L）
A 8.0 8.0 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品
B 4.0 4.0 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品
C 2.0 2.0 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品
D 1.0 1.0 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品
E 0.5 0.5 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品
F 0.25 0.25 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品
G 0 0 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品
H 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品
局限
6号标准品以上的结果为非线性的，根据此标准曲线无法得到的结果。
试剂盒性能
1. 灵敏度：zui小的检测浓度小于1号标准品。稀释度的线性。样品线性回归与预期浓度相关系数R值为0.990。
2. 特异性：不与人其它细胞因子反应。
3. 重复性：板内、板间变异系数均小于10%。
结 果 判 断 与 分 析
1、仪器值：于波长450nm的酶标仪上读取各孔的OD值
2、以吸光度OD值为纵坐标（Y），相应的NF-κB-P65标准品浓度为横坐标（X），做得相应的曲线，样品的NF-κB-P65含量可根据其OD值由标准曲线换算出相应的浓度。
3、检测值范围：0-8.0umol/L
4、敏感度： 0.01 umol/L
人干细胞因子/肥大细胞生长因子（SCF/MGF）ELISA试剂盒 Human Stem cell factor/mast cell growth factor,SCF/MGF ELISA试剂盒
人可溶性CD40配体（sCD40L）ELISA试剂盒 Human Soluble Cluster of differentiation 40 ligand,sCD40L ELISA试剂盒
人可溶性CD30配体（sCD30L）ELISA试剂盒 Human Soluble Cluster of differentiation 30 ligand,sCD30L ELISA试剂盒
人正常T细胞表达和分泌因子（RANTES/CCL5）ELISA试剂盒 Human regulated on activation in normal T-cell expressed and secreted,RANTES ELISA试剂盒
人P选择素（P-Selectin/CD62P/GMP140）ELISA试剂盒 Human P-Selectin/CD62P/GMP140 ELISA试剂盒
人血血小板衍生生长因子AB（PDGF-AB）ELISA试剂盒 Human Plaet-Derived Growth Factor AB,PDGF-AB ELISA试剂盒
人血血小板衍生生长因子可溶性受体α（PDGFsR-α）ELISA试剂盒 Human Plaet-Derived Growth Factor Soluble Receptor α,PDGFsR-α ELISA试剂盒
人神经营养因子4（NT-4）ELISA试剂盒 Human Neurotrophin 4,NT-4 ELISA试剂盒
人神经营养因子3（NT-3）ELISA试剂盒 人神经营养因子3（NT-3）ELISA试剂盒
人的神经生长因子（NGF）ELISA试剂盒 Human Nerve growth factor,NGF ELISA试剂盒
人巨噬细胞炎性蛋白3β（MIP-3β/ELC/CCL19）ELISA试剂盒 Human Macrophage Inflammatory Protein-3β,MIP-3β ELISA试剂盒
人巨噬细胞炎性蛋白3α（MIP-3α/CCL20）ELISA试剂盒 Human Macrophage Inflammatory Protein-3α,MIP-3α ELISA试剂盒
人巨噬细胞炎性蛋白1β（MIP-1β/CCL4）ELISA试剂盒 Human Macrophage Inflammatory Protein-1β,MIP-1β ELISA试剂盒
人黏膜地址素细胞黏附分子（MAdCAM-1）ELISA试剂盒 Human mucosal addressin cell adhesion molecule-1,MAdCAM-1 ELISA试剂盒
人β干扰素（IFN-β/IFNB）ELISA试剂盒 Human Interferon β,IFN-β/IFNB ELISA试剂盒
人可溶性CD38（sCD38）ELISA试剂盒 Human Soluble Cluster of differentiation 38,sCD38 ELISA试剂盒
