免疫组化抗原热修复的技术要点（供参考）

 1、 抗原热修复温度和时间的关系
我们日常工作中所使用的组织固定液福尔马林会引起组织蛋白内或蛋白之间的亚甲基发生桥连，具体过程如下：
*步基本反应福尔马林和氢反应形成新的化合物
第二步基本反应福尔马林和氢反应形成新的亚甲基桥
上述反应的结果导致许多抗原决定簇被封闭，而加热可以水解该桥连使抗原被激活。影响抗原热修复的两个zui关键的因素是温度和时间，有人将这两种因素对抗原修复的影响总结为下面的公式：
抗原热修复的有效性=加热温度（T） × 加热时间（t）
也就是说当我们修复时的温度越低则需要修复的时间就越长；反过来当修复温度增高时修复的时间可以适当地缩短，才能使抗原决定簇*暴露，这种反比的关系从抗体的实验结果表1中也可以清楚地看出。
时间和温度对染色的影响
时间（分钟）
100℃ 80℃ 60℃
10 + + + ― ―
30 + + + + + + + ―
50 ― + + + + +
10小时 ― ― + +
如果修复强度不够，免疫组织化学染色所显示的只能是修复后暴露的部分抗原决定簇，而不是组织所含的全部抗原。这样的染色结果可能会非常弱，或出现假阴性，即使是阳性结果，充其量只能起到定性的作用，不能适应今后对免疫组化进行定量的需要。这就给我们诊断中定量指标的应用带来困难，例如用来测定耐药的指标。

2、 组织固定时间和所需的抗原热修复的关系
大量的实验表明，固定时间越长的标本，它所形成的桥连就越紧密，抗原就越难以被激活，所需要的修复强度也就越强。有意思的是随着固定时间的延长，组织中蛋白对温度的耐受也相应增高（如图1所示），这可能就是我们对固定时间长的标本加大修复强度的理论基础。
图一 固定时间和变性的关系
这就提醒我们在做回顾性的研究时一定要注意所使用的修复条件，它与新鲜标本的修复条件一定是有所区别的，同等条件下一定要加长修复的时间或提高修复所使用的温度，才可能得到比较满意的结果。

3、 不同PH值抗原修复液对染色结果的影响
抗原热修复中所使用的修复液PH值也会对染色结果产生相当大的影响。PH值对染色结果的影响大概可以分为以下四种情况。
A―稳定型，PH值对染色结果影响不大，如PCNA、AE1、EMA、CD20等。
B―V型，高PH值和低PH值染色较好，而PH值4-5染色结果较差，如ER、Ki-67等。
C―上升型，随着PH值的增加，染色结果逐渐增强，如HMB45等。
D―下降型，随着PH值的增加染色结果逐渐减弱，当然这种类型的抗体只是个别的现象，如MOC31。 一个有趣的现象值得注意，即在高PH值（图中圆圈所示约PH8.0~9.0），A、B、C三者都有较好的染色结果，所以目前比较推崇的抗原修复液为高PH值得修复液，如1mMEDTA, PH8.0或PH9.0等。但是由于传统习惯，绝大多数医院和实验室都在使用PH6.0的枸橼酸缓冲液。综合以上各种抗体的染色状况，考虑到临床工作的实际情况，许多国外免疫组化专家建议，在常规的免疫组化工作中，全部选用高PH值得修复液来代替目前广为使用的PH6.0枸橼酸缓冲液。为此，本公司已经推出PH8.0和PH9.0的新型抗原修复液。经验证，绝大多数的抗体使用PH9.0得修复液效果都要优于PH6.0的枸橼酸，尤其是核阳性的抗体。所以，在常规的免疫组化工作中，使用高PH值的抗原修复液是今后的必然趋势。
4、 抗原热修复的手段
微波炉修复和高压锅修复的比较
温度 压力 v时间 受热
微波炉 100℃ 1P 15~20分钟 不均匀
高压锅 120℃ 1.2P 喷气2分钟 均匀
目前抗原热修复所采用的方法主要有微波炉修复和高压锅修复两种，从表中可以看出，由于高压锅修复具有温度均一、节省时间、效果稳定等特点，已经越来越受到人们的青睐。

石蜡切片免疫组化染色步骤
三步法（以SP试剂盒为例）
●石蜡切片脱蜡至水。
●蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟，如果采用抗原修复，可在此步后进行。
●3%H2O2室温孵育5~10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性，PBS冲洗，2分钟×3次。
●5~10%正常山羊血清封闭，室温孵育10分钟。倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2小时或4℃过夜。
●PBS冲洗，2分钟×3次。
●滴加适当比例稀释的生物素标记二抗（1%BSA-PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育10~20分钟。
●PBS冲洗，2分钟×3次。
●滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素（PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃或室温孵育10~20分钟。
●PBS冲洗，2分钟×3次。
●显色剂显色（DAB或AEC）。
●自来水充分冲洗，复染，脱水透明、封片。
●如果必要，可选用avdin封闭内源性生物素。

冰冻切片的免疫组化染色步骤
●速冻组织
●冰冻切片4~8μm，冰冻切片后如不染色，必须吹干，储存低温冰箱内，或进行短暂预固定后储存于-20℃冰箱。
●室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟。也可根据需要选择其他的固定方式。
●PBS冲洗，5分钟×3次。
●用3%过氧化氢孵育5~10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。
●PBS冲洗，5分钟×3次。
●下接石蜡切片免疫组化染色操作步骤（滴加一抗开始）。