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细胞生物学系列 CAT#：81026-10
低温运输，-20℃保存 RICKY
一站式生物素检测TUNEL试剂盒
One-Stop Biotin-Based TUNEL Kit
 使用手册V1.1

上海瑞齐生物

一站式生物素检测TUNEL试剂盒
原理及特点 TUNEL就是末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP切口及末端标记（TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling），它是一种高灵、敏度、快速检测细胞凋亡的方法。其原理是在发生凋亡细胞中会有大量的具有切口的 、或具有游离3’-OH端、长度是180-200 bp倍数的 段， TdT （末端脱氧核苷酸转移酶）可以以不依赖模板的方式进行标记，如参入荧光素、生物素或地高辛等标记的dUTP，而正常细胞DNA几乎没有游离的3’-OH和切口，所以通过对标记物的显色反应和荧光显微镜或流式细胞仪检测就可以区分正常和凋亡的细胞。此过程的示意图如下：
DNA末端标记 DNA切口标记
  
   本试剂盒有如下特点：
1. 一站式，不需要额外准备的试剂（但客户还是需要自备常规的试剂，如水、PBS和细胞涂片所需试剂）。
2. 高灵敏度，可以在单细胞水平检测到细胞凋亡，适合检测早期的细胞凋亡。
3. 特异性高，只标记凋亡细胞，而不标记坏死细胞。
4. 快速，整个操作过程仅需1-2个小时即可完成。
5. 方便，一步染色反应，洗涤后即可观察，不必使用二抗等进行多步操作。
6. 适用于组织样本（石蜡包埋、冰冻和超薄切片）和细胞样本（细胞涂片）。
规格及成分 成份 10次塑料袋包装
1×TdT Buffer 0.5 mL
TdT酶（20 U/uL） 10 uL
Proteinase K溶液（200 ug/mL） 1 mL
Streptavidin-HRP 50 uL
DAB干粉 1 mg
使用手册 1份

运输及保存 低温运输，-20℃保存，有效期一年
自备试剂 二甲苯、多聚甲醛、PBS、H2O2、Triton X-100、柠檬酸钠、苏木素染液、超纯水。
使用方法 一：样本预处理（操作步骤仅供参考，本试剂盒不提供相关试剂）
下面所用的固定液、淬灭液和通透液均需要新鲜配制。固定液是溶于pH 7.4 的PBS中的、浓度为4%的多聚甲醛溶液；淬灭液是用甲醇将H2O2原液（30%）稀释到3%而得；通透液是溶于0.1%柠檬酸钠中的、浓度为0.1% 的Triton X-100溶液。
对贴壁细胞或细胞涂片
1. 将自然晾干的贴壁细胞或细胞涂片浸入固定液中室温固定30-60分钟。为改善细胞的渗透性，可将固定好的样本放在70%乙醇中-20℃放置过夜。为防止样本脱落，可使用硅烷处理的载玻片或采用多聚赖氨酸铺片。
2. 用自备的PBS漂洗2次，每次5分钟。
3. 浸入淬灭液中室温放置10分钟后，用PBS漂洗2次，每次5分钟。
4. 浸入通透液中，冰上放置2分钟后，用PBS漂洗 2次，每次5分钟。用吸水纸吸干样本周围水分。待用。
对石蜡组织切片
1. 将切片置于染缸中，用二甲苯脱蜡2次，每次5分钟；再分别用100%、95%、90%、80%、70%的乙醇和PBS各洗一次，每次3分钟。
2. 在每张切片上滴加100 uL蛋白酶K工作液（10 uL蛋白酶K溶液+90 uL PBS缓冲液）并在室温放置15-30分钟以降解交联的蛋白和其他内源蛋白。注意：蛋白酶K工作液的用量和处理时间一般都需根据样品的不同而单独进行优化，此处的用量只供参考。蛋白酶K处理后不需要再淬灭内源蛋白酶。
3. 用PBS漂洗4次，每次3分钟。此步不能省略，否则残留的蛋白酶K将会降解后面降压加入的TdT。用吸水纸吸干样本周围水分。待用。
对冰冻切片
1. 将切片在固定液中室温固定20-60分钟，PBS洗涤2次，每次10分钟。
2. 浸入淬灭液中室温放置10分钟后，用PBS漂洗两次，每次5分钟。
3. 浸入通透液中冰上放置2分钟后，用PBS漂洗两次，每次5分钟。用吸水纸吸干样本周围水分。待用。一站式生物素检测TUNEL试剂盒
阳性对照样本
1. 所有处理步骤跟样品一样，只是在zui后还需在样品上滴加100 μL自备的 DNase I反应液室温放置10-30分钟。反应液含40 mM Tris-HCl pH 7.9，10 mM NaCl，6mM MgCl2，10mM CaCl2和不同浓度的DNase I（冷冻切片需3U/mL、石蜡切片需1500 U/mL、一般样本需10 U/mL）。用PBS洗两次，每次5分钟。用吸水纸吸干周围水分后待用。
二．标记和显色反应
2. 配制所需量的TdT酶反应液：将1 uL TdT酶加入到 50 uL 1×TdT Buffer 中即可。TdT酶反应液需即用即配，不宜保存，否则酶会失活。
3. 在除阴性对照外的每个样本上滴加50 uL TdT酶反应液，加盖玻片后37℃避光放置60分钟。注意：加盖玻片可使反应液均匀分布，并避免其挥发。阴性对照只滴加50 uL不含TdT酶的反应液。
4. 用自备的PBS清洗3次，每次 5分钟，用吸水纸吸干样本周围残留液体。
5. 将5 uL Streptavidin-HRP溶液加入45 uL PBS中，混匀后全部加在切片上并加盖玻片，37℃避光放置30分钟。
6. 用自备的PBS清洗4次，每次5分钟，用吸水纸吸干样本周围残留液体。
7. 滴加50 uL 新鲜配制的DAB工作液（将1 mg DAB干粉溶于1 mL PBS中，取50uL与1 uL 30% H2O2混合即得DAB工作液，剩余的DAB溶液可-20℃避光保存），室温显色10分钟。
8. PBS漂洗4次，前3次每次1分钟，zui后1次5分钟。
9. 光学显微镜下观察、拍照。亦可用苏木素或甲基绿复染复染后再观察。
问题及解答 现象 可能原因 建议
非特异性染色 Biotin-dUTP非特异性结合 勿使细胞干涸
 TdT酶的浓度过高 将TdT酶稀释1-10倍
 内源过氧化物酶未被淬灭 用淬灭液室温淬灭10分钟
 内源核酸酶或聚合酶活性高 取样后立即固定
染色背景较高 内源过氧化物酶未被淬灭 用淬灭液室温淬灭10分钟
 样本被支原体污染 制备未被污染的新样本
 标记反应过强 将TdT酶稀释2-5倍
 细胞处于高度增殖期 在非高增殖期取样检测
 DAB孵育时间过长 减少DAB染色时间
 标记率低、染色淡至无 固定剂（乙醇或甲醇）效果差 改用多聚甲醛或戊二醛
 固定时间过长导致过度交联 缩短固定时间
 促渗条件不佳 增加通透剂促渗时间

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