【摘要】 ［目的］应用荧光差异显示技术筛选胃癌中特异表达的基因，并验证其在胃癌、食管癌中的表达，为进一步了解胃癌、食管癌发生、发展的分子机制提供帮助。［方法］应用荧光差异显示技术（DD-PCR）分析胃癌及其相对应的正常胃黏膜组织，获得差异表达的基因片段，这些片段经过二次PCR再扩增后进行克隆和测序，通过在GenBank中同源性检索，查找与差异片段相对应的同源基因。应用半定量PCR,荧光定量PCR等方法进一步验证该基因在胃癌及食管癌中的表达差异。［结果］通过DD-PCR得到的差异片段中的一个片段对应于人Ⅰ型胶原蛋白基因。该基因的读码框长4 395bp，编码1 464个氨基酸，编码蛋白分子量约139.01kD。该基因在胃癌及食管癌组织中的表达量高于其对应的癌旁组织，并且在食管癌组织中的表达差异较胃癌中更明显。［结论］人Ⅰ型胶原蛋白基因在胃癌及食管癌中均呈高表达，推测其可能在胃癌及食管癌的发生发展中起作用。
【关键词】 基因Ⅰ型胶原蛋白 胃肿瘤 食管肿瘤 荧光差异显示 聚合酶链反应
分子生物学研究表明癌基因、抑癌基因和细胞周期控制基因的异常表达参与了胃癌及其他恶性肿瘤的演进[1]。目前许多胃癌特异表达基因已被鉴定及研究，如p53基因、谷胱甘肽S2转移酶基因等，但胃癌发生、发展的确切机制仍未阐明，因此寻找胃癌中新的特异表达的基因对胃癌的基础研究与临床研究有重要意义。本试验应用荧光差异显示方法（DD-PCR）筛选到胃癌中差异表达的Ⅰ型胶原蛋白基因，并利用mRNA定量分析方法检测该基因在胃癌及食管癌组织中与其对应癌旁组织之间表达的差异。
1 材料与方法
1.1 临床材料
实验中标本来自2006年3月至2006年6月间于江苏大学附属医院接受手术治疗的胃癌患者12例及食管癌患者14例。每例患者均取手术切除的癌组织及癌旁组织（距离癌组织约2~3cm），并经病理检查证实。组织离体后立即在液氮中速冻，并置于-70℃冰箱中保存。
1.2 试剂和仪器
RNA提取试剂Trizol购自Invitrogen公司，荧光差异显示试剂盒购于Genhunter公司，SuperScriptⅡ反转录试剂盒购于Gibco公司，荧光定量PCR试剂盒购于TaKaRa公司。主要仪器有FMBIO?誖Ⅱ（HITACHI）荧光差异显示系统，STRATAGENE MX3000P荧光定量PCR仪，GenspecⅢ（HITACHI）。
1.3 cDNA的制备
用Trizol提取的方法提取胃癌、食管癌组织及其癌旁组织的RNA，使用Gens-pecⅢ测定总RNA的浓度，经DNase消化后，反转录得到胃癌、食管癌及其癌旁组织的cDNA。
1.4 DD-PCR
3种荧光引物（FHT12A，FHT12G，FHT12C）与21种试剂盒中的随机引物做不同组合，进行荧光差异显示PCR（DD-PCR），PCR产物8μl上样于6%的聚丙烯酰胺凝胶，1 400V恒压电泳5h左右。
1.5 差异片段的克隆
差异条带经切割和处理后作为模板，进行二次PCR，将产物连接于T载体。连接产物转化大肠杆菌DH5α，蓝白斑筛选阳性克隆。阳性克隆经酶切鉴定后测序（上海生工）。
1.6 荧光定量PCR分析
利用Primer5.0软件设计用于定量PCR的胶原蛋白Ⅰ型基因引物，内参选用人β-actin，检测胶原蛋白Ⅰ型基因在胃癌、食管癌组织及其癌旁组织中表达的差异。引物序列为：胶原蛋白Ⅰ型基因：5-GAGAGCATGACCGATGGAT，3′-ATGTTTTGGTGGT-
TCAGGAGG；内参β-actin：5′-GAGACCTT CAACACCCCAGCC，3′-GGAGTACAGGTCTTTGCGGATG。扩增片段长度分别为280bp和512bp。反应条件为94℃ 30s，57℃ 30s，72℃ 35s。根据2-ΔΔCt公式计算基因相对拷贝数，利用SPSS13.0软件对获得的数据进行分析。
1.7 半定量PCR分析
为了对荧光定量PCR的结果进一步检验，用做定量PCR的两对引物对不同模板cDNA分别作了半定量PCR，反应条件为94℃ 30s，57℃ 30s，72℃ 35s 25个循环。通过凝胶成像系统软件对所得电泳条带进行亮度和面积的分析，得出数据，然后用SPSS13.0软件处理，得到直观的图象。
2 结 果
2.1 阳性差异片段的筛选
聚丙烯酰胺凝胶电泳结果发现，胃癌组织和癌旁组织中基因的表达存在差异性。为进一步了解这些差异片段的信息，将差异片段切出后，进行二次扩增，并对扩增到的片段进行克隆和序列分析。将测序获得的序列在NCBI数据库中进行比对，其中编号为G1的差异片段与GenBank中的人Ⅰ型胶原蛋白基因同源性达到100%（GenBank：BC036531）。
2.2 半定量PCR分析
本研究中取4例胃癌、3例食管癌标本对人Ⅰ型胶原蛋白基因在癌组织及相应癌旁组织中的表达量进行半定量分析。由图1、图2可看到人Ⅰ型胶原蛋白基因在胃癌及食管癌组织及其癌旁组织中均有表达，但在癌中的表达量高于旁组织，并且食管癌组织中的表达差异比胃癌中更明显。通过凝胶成像系统软件对所得电泳条带进行亮度和面积的分析，然后用SPSS13.0软件处理，得到直观的图象，人Ⅰ型胶原蛋白基因在胃癌组织中的表达量高出癌旁组织约1.5倍（图3），在食管癌组织中的表达量高出癌旁组织约2倍（图4）。
2.3 荧光定量PCR分析
应用12例胃癌、14例食管癌标本对人Ⅰ型胶原蛋白基因在胃癌、食管癌及癌旁组织的表达量进一步检测。应用SPSS13.0软件作定量分析，结果表明，人Ⅰ型胶原蛋白基因在胃癌及食管癌组织中的表达量高于其相应的癌旁组织，差异具统计学意义（P<0.05），且食管癌组织中的表达差异比胃癌中更明显（图5、图6）。
3 讨 论
mRNA差异显示法于1992年由Liang等[2]首先建立。经过不断改进，目前这一技术已比较成熟。它仅需少量的总RNA（0.02~0.2μg），因此需要较少的组织标本，并且具有灵敏度高、快速、应用范围广等优点，该方法可以鉴别不同生理、病理状态下基因的表达，已被证实能有效地筛选肿瘤恶性转化进程中差异表达的基因[3]。本研究应用mRNA差异显示技术筛选到胃癌中高表达的Ⅰ型胶原蛋白基因，应用mRNA定量PCR及半定量方法进一步验证发现该基因在胃癌及食管癌组织中表达量高于其对应的正常组织。
Ⅰ型胶原蛋白是哺乳动物细胞zui丰富的蛋白质,其编码基因长约40kb，包含了52个外显子，编码蛋白质的单体〆肽链包含1 464个氨基酸残基[4]。研究证实，Ⅰ型胶原蛋白基因在多种肿瘤（如胰腺癌[5]、乳腺癌[6]、前列腺癌[7]等）中呈高表达，Demou等[8]学者发现Ⅰ型胶原纤维蛋白基因尾肽缺乏可促进乳腺癌细胞转移，Moro等[9]发现在前列腺癌中，Ⅰ型胶原蛋白基因可通过下调抑癌基因BRCA2表达而促进前列腺癌细胞增殖，Lianq等[10]发现在脑肿瘤中，Ⅰ型胶原蛋白基因表达增高是构成肿瘤微环境的重要成分，本实验发现该基因在胃癌及食管癌中高表达，提示Ⅰ型胶原蛋白基因在恶性肿瘤中的高表达可能具有普遍性。另外，已有研究表明Ⅰ型胶原蛋白在鳞癌比在腺癌中表达更具有活性[11]，食管癌90％以上组织学分型为鳞癌，而胃癌85％以上均为腺癌[12]，这与我们在研究过程中发现Ⅰ型胶原蛋白基因在食管癌中表达较在胃癌中表达更有差异性是一致的。对Ⅰ型胶原蛋白基因的功能、Ⅰ型胶原蛋白基因在其他恶性肿瘤中是否也高表达以及在胃癌及食管癌中具体通过何种途径发挥促癌作用等方面进行深入研究，将有助于解析肿瘤形成、发展的机制。
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