当FITC在碱性溶液中与抗体蛋白反应时，主要是蛋白质上赖氨酸的r氨基与荧光素的硫碳胺键（thiocarbmide）结合，形成FITC-蛋白质结合物，即荧光抗体或荧光结合物。一个IgG分子中有86个赖氨酸残基，一般zui多能结合15～20个，一个IgG分子可结合2～8个分子的FITC，其反应式如下
FITC-N=C=S + N-H2-蛋白质 → FITC-NS-C-N-H2-蛋白质
常用Marsshall（1958）法标记荧光抗体，也可以根据条件采用Chadwick等标记法或Clark等（1963）的透析标记法。
1．Marsshall法
（1）材料 抗体球蛋白溶液、0．5mol／L（pH9．0）碳酸盐缓冲液、无菌生理盐水、异硫氰酸荧光
素、1％硫柳汞水溶液、50ml小烧杯、4℃冰箱、电磁搅拌器、透析袋、玻棒、pH7．2或
3．0的0．01mol／LPBS等。
（2）方法及步骤 ①抗体的准备 取适量已知浓度的球蛋白溶液于烧杯中，再加人生理盐水及碳酸盐缓冲液，使zui后免疫球蛋白浓度为20mg／ml，碳酸盐缓冲液容量为总量的1／10，混匀，将烧瓴置电磁搅拌器上（速度适当以不起泡沫为宜）5～10min。
②荧光素的准备 根据欲标记的蛋白质总量，按每毫克免疫球蛋白加0．01mg荧光色素，用分析天平准确称取所需的异硫氰酸荧光素粉末。也可用下述公式计算出免疫球蛋白、荧光素的量，还可以算出需加缓冲液的量。
a．蛋白溶液：含量Amg／m1；容积Bml。
b．总蛋白量（AXB）＝Crag。
c．C／20～C／10＝Dmg（如蛋白含量低于20mg／ml，用C／10；如高于20mg／ml，用C／20）。
d．荧光素FITC的量：（1／50～2／100）XC＝Emg。
e．巳0．5mol／L（pH9．5）碳酸盐缓冲液D／10＝Fml。
f． PBS量D-（B+F）=Gml。
注：A为蛋白含量，mg／ml；B为蛋白质溶液的容积；C为蛋白总量，mg；D为常数，mg；正为荧光素的量，mg；F为碳酸盐缓冲液的容积，ml；G为PBS的容积，ml。
③结合（或标记） 边搅拌边将称取的荧光色素渐渐加入球蛋白溶液中，避免将荧光素粘于烧瓶壁（大约在5—10min内加完），加完后，继续避光搅拌12h左右。结合期间应保持蛋白溶液于4℃左右，故需将烧杯和搅拌器一起移人4℃冰箱中。
④透析 结合完毕后，将标记的球蛋白溶液离心（2500r／min）20rain，除去其中少量的沉淀物，装入透析袋中，再置于烧杯中，用pH8．0缓冲盐水透析（0～4~C）过夜。
⑤过柱 取透析过夜的标记物，通过葡聚糖凝胶SephadexG-25或G—50柱，分离游离荧光素，收集标记的荧光抗体进行鉴定。洗脱液：0．01mol／L磷酸盐缓冲液（pH7．2）；过滤量：12ml标记蛋白液（过滤前未透析）；收集量：20ml（稀释1．7倍左右）。
2．Chadwick法
（1）试剂和材料 抗体球蛋白溶液、异硫氰酸荧光素、3%碳酸钠水溶液、0．01mol/L pH8.0PBS、1%硫柳汞、离心机及离心管、烧杯（25ml）搅拌器、无菌吸管，无菌吸管及毛细滴管、烧杯（500ml）透析袋等。
（2）方法及步骤 ①抗体准备 用o～4~C的pH8。0磷酸盐缓冲盐水将球蛋白溶液稀释至浓度为30～40mg／ml，置入25ml烧杯内，放于冰槽中。
②荧光色素准备 按每毫克免疫球蛋白加入荧光素0．01rug计算，称取所需的荧光素，用3％碳酸钠水溶液溶解。
③将准备的抗体与荧光色素溶液等量混合，充分搅匀，在o～4~C冰箱中结合（在磁力搅拌机上持续搅拌）18～24h。
④透析和柱层析 方法同Marsshall法。
3．改良法
（1）试剂和材料 ①0．01mol／L（pH7．2）PBS配法中，校定pH至7．2。NaCi 18g、Na2HP04 1．15g，溶于2000ml蒸馏水
②0．5mol／L（pH9．0）碳酸盐缓冲液配法 取0．5mol／LNazCOs（5．3％）10ml加入0．5mol／LNaHC03（4．2％）90ml，混合后，校定pH至9．0。
③3％碳酸钠水溶液配法 称L 5g无水碳酸钠充分溶解于50ml灭菌蒸馏水中即成。
④其他试剂和材料 l％*、离心机及离心管、烧杯（25m1）、搅拌器、无菌吸管及毛细滴管、烧杯（500m1）透析袋等。
（2）方法及步骤 ①取价的抗人球蛋白兔免疫血清，分离球蛋白，用盐水（0．15mol／LNaCl）及缓冲液（0．5mol／LNaHC03—Na2C03，pH9．0）稀释使每毫升内含蛋白质lOmg，缓冲液为总量的10％，降温至4℃。
②加入异硫氰酸盐（FITC）荧光素[蛋白：荧光素＝（50—80）mg‘lmg]，在0～4~C
下电磁搅拌12～14h。
③然后用半饱和的硫酸铵将标记球蛋白沉淀分离，除去未结合的荧光素，再用缓冲盐水透析，除去硫酸铵（用Nessler试剂测验，至隔夜透析的盐水无氨离子及荧光色素为止）。
④将制备好的荧光抗体加*o．01％，分装在lml安瓿中，或冻干，保存于冰箱中（4℃）可以用半年以上，一20~C保存可达2年以上。
4．透析标记法
此法适用于小量抗体的荧光素标记，标记简便，非特异性染色较少。
（1）试剂和材料 试剂和材料同改良法。
（2）方法及步骤 ①用0．025mol／L碳酸盐缓冲液pH9．0，将欲标记免疫球蛋白稀释成1％浓度，装入透析袋中。
②用同一缓冲液将FITC配成0．1mg／ml的溶液，按10mg／ml球蛋白溶液体积的10倍，将FITC稀释液盛于圆柱形容器内，并使透析袋浸没于FITC液中。
③容器顶端盖紧，底部放搅拌棒，在4~C电磁搅拌下透析标记24h。取出透析袋中标记液，即刻用SephadexG50凝胶过滤，去除游离荧光素，分装，贮存于4℃中。
