随机扩增多态DNA 的方法和应用
1.RAPD 技术的原理和特点
RAPD 技术建立在PCR 技术的基础上,它是利用一系列随机排列的寡核苷酸(通常为十聚体)为引物,对所研究的基因组DNA 进行PCR 扩增。扩增产物通过聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳分离后,经EB 染色或放射自显影来检测扩增产物DNA 片段的多态性,这些扩增DNA 片段的多态性反映了基因组相应区域的DNA 多态性。
RAPD 所用的一系列引物各不相同,但对于任一特定的引物来说,它同基因组DNA 序列有其特定的结合位点。这些特定的结合位点在基因组的某些区域内的分布如符合PCR 扩增条件,即引物在模板的两条链上有互补位置,且引物的3 端相距在一定长度范围之内,就可扩增出片段。因此,如果基因组在这些区域发生DNA 片段的插入、缺失或碱基突变,就可能导致这些结合位点的分布发生相应的变化。通过对 PCR 产物的检测即可探知基因组DNA 在这些区域内的多态性。
进行RAPD 分析时可用引物数很多,虽然对每一个引物而言,其检测基因组DNA 多态性的区域是有限的,但利用一系列引物则可使检测区域覆盖整个基因组。因此,RAPD 可以对整个基因组进行多态性检测。
RAPD 技术与其他DNA 多态性检测技术如 RFLP ( restriction fragment length polymorphism)、DNA 指纹图(DNA finger-printing)、SSCP(singer-strind conformatation polymorphism)等相比,还具有以下几个特点:①RAPD 技术可以在对受试物种(包括动物、植物和微生物)缺乏任何分子生物学研究的背景下,直接对基因组进行多态性分析;②操作简便,一次RAPD 扩增实际上就是一次简单的PCR 反应,适合大量样本的快速分析;③所需模板DNA 量极少,一般一次扩增只需5~50ng 的DNA。因此可以从毛发、脱落组织甚至动物的排泄物中提取微量DNA 进行直接扩增。这对于濒危动物和价值很高的种畜、禽的基因组分析是十分有效的(王文等 1994;陈*等 1997,1998;Gwakisa 等 1994;Yi 1995;Tibayrenc 等 1993;Wachira 1995)。
2. RAPD 的基本操作方法
RAPD 的操作方法大体上包括DNA 提取、扩增、电泳和染色等几个主要步骤。具体的操作过程见 Williams 等(1990,1993)和 Welsh 等(1990)的论述。随着 RAPD 技术的发展,该技术也作了一些改动(Bucci,Menozzi 1993;Dawson 等1993;Lawson 等1994)。
2.1 RAPD 模板的制备 随机扩增多态DNA 的方法和应用
2.l.1 动物组织总 DNA 的提取
取新鲜动物组织材料,如肝脏、肾脏或肌肉等10~100mg,剪碎后加入750μl 的STE(0.1mol/dm3 NaCl,20mmol/dm3EDTA,10mmol/dm3 Tris-HCl,pH 值 8.0)、80μl 10%SDS和8μl 20mg/ml 的蛋白酶K。在56℃下消化12~24/小时后,用酚、氯仿、异戊醇(25:24:1)和氯仿-异戊醇(24:1)分别抽提一次。每次抽提时间为12~24 小时。上清液用等体积的异丙醇沉淀及70%的乙醇清洗。沉淀干燥后,用适量的TE 溶解,置于4℃冰箱中备用。(生物秀实验频道——打造专业生物实验中心 www.bbioo.com)
2.1.2 植物及其真菌的总DNA 提取
取50~500mg 植物或真菌的新鲜材料,分别经95%的乙醇、70%的乙醇和超净水清洗。将材料剪碎后,在材料中加入700μl 十六烷基*基溴化铵(CTAB)提取液(2%CTAB,1.4mol/dm3NaCl,0.2% 2-巯基乙醇,20mmol/dm3EDTA,100mmol/dm3Tris-HCl,pH 值8.0)。在56℃下消化12~24 小时。用酚、酚-氯仿-异戊醇(25:24:1)和氯仿-异戊醇(24:1)分别抽提一次,每次抽提时间为12~24 小时。将上清液用等体积的异丙醇沉淀后,用70%的乙醇清洗。沉淀干燥后,用适量的TE 溶解,然后置于 4℃冰箱中备用。