随机扩增多态DNA 的方法和应用

 

1.RAPD 技术的原理和特点

RAPD 技术建立在PCR 技术的基础上，它是利用一系列随机排列的寡核苷酸（通常为十聚体）为引物，对所研究的基因组DNA 进行PCR 扩增。扩增产物通过聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳分离后，经EB 染色或放射自显影来检测扩增产物DNA 片段的多态性，这些扩增DNA 片段的多态性反映了基因组相应区域的DNA 多态性。

RAPD 所用的一系列引物各不相同，但对于任一特定的引物来说，它同基因组DNA 序列有其特定的结合位点。这些特定的结合位点在基因组的某些区域内的分布如符合PCR 扩增条件，即引物在模板的两条链上有互补位置，且引物的3 端相距在一定长度范围之内，就可扩增出片段。因此，如果基因组在这些区域发生DNA 片段的插入、缺失或碱基突变，就可能导致这些结合位点的分布发生相应的变化。通过对 PCR 产物的检测即可探知基因组DNA 在这些区域内的多态性。

进行RAPD 分析时可用引物数很多，虽然对每一个引物而言，其检测基因组DNA 多态性的区域是有限的，但利用一系列引物则可使检测区域覆盖整个基因组。因此，RAPD 可以对整个基因组进行多态性检测。

RAPD 技术与其他DNA 多态性检测技术如 RFLP （ restriction fragment length polymorphism）、DNA 指纹图（DNA finger-printing）、SSCP（singer-strind conformatation polymorphism）等相比，还具有以下几个特点：①RAPD 技术可以在对受试物种（包括动物、植物和微生物）缺乏任何分子生物学研究的背景下，直接对基因组进行多态性分析；②操作简便，一次RAPD 扩增实际上就是一次简单的PCR 反应，适合大量样本的快速分析；③所需模板DNA 量极少，一般一次扩增只需5～50ng 的DNA。因此可以从毛发、脱落组织甚至动物的排泄物中提取微量DNA 进行直接扩增。这对于濒危动物和价值很高的种畜、禽的基因组分析是十分有效的（王文等 1994；陈*等 1997，1998；Gwakisa 等 1994；Yi 1995；Tibayrenc 等 1993；Wachira 1995）。

2. RAPD 的基本操作方法

RAPD 的操作方法大体上包括DNA 提取、扩增、电泳和染色等几个主要步骤。具体的操作过程见 Williams 等（1990，1993）和 Welsh 等（1990）的论述。随着 RAPD 技术的发展，该技术也作了一些改动（Bucci，Menozzi 1993；Dawson 等1993；Lawson 等1994）。

2.1 RAPD 模板的制备 随机扩增多态DNA 的方法和应用

2.l.1 动物组织总 DNA 的提取

取新鲜动物组织材料，如肝脏、肾脏或肌肉等10～100mg，剪碎后加入750μl 的STE（0.1mol／dm3 NaCl，20mmol／dm3EDTA，10mmol／dm3 Tris-HCl，pH 值 8.0）、80μl 10％SDS和8μl 20mg／ml 的蛋白酶K。在56℃下消化12～24／小时后，用酚、氯仿、异戊醇（25:24:1）和氯仿－异戊醇（24:1）分别抽提一次。每次抽提时间为12～24 小时。上清液用等体积的异丙醇沉淀及70％的乙醇清洗。沉淀干燥后，用适量的TE 溶解，置于4℃冰箱中备用。（生物秀实验频道——打造专业生物实验中心 www.bbioo.com）

2.1.2 植物及其真菌的总DNA 提取

取50～500mg 植物或真菌的新鲜材料，分别经95％的乙醇、70％的乙醇和超净水清洗。将材料剪碎后，在材料中加入700μl 十六烷基*基溴化铵（CTAB）提取液（2％CTAB，1.4mol／dm3NaCl，0.2％ 2-巯基乙醇，20mmol／dm3EDTA，100mmol／dm3Tris-HCl，pH 值8.0）。在56℃下消化12～24 小时。用酚、酚－氯仿－异戊醇（25:24:1）和氯仿－异戊醇（24:1）分别抽提一次，每次抽提时间为12～24 小时。将上清液用等体积的异丙醇沉淀后，用70％的乙醇清洗。沉淀干燥后，用适量的TE 溶解，然后置于 4℃冰箱中备用。