技术文章

    虽然有数百种不同的翻译后修饰，但许多修饰不能用特异的放射活性前体进行研究。因为从商业角度考虑，并不总是能得到正确的前体。前体亦不能被细胞摄取，或细胞内池不够大，不能得到具有高特异性的活性分辨基团等。然而，仍有很多修饰过程可用此法研究。

    通过免疫沉淀／免疫印迹检测酪氨酸磷酸化

    蛋白质在酪氨酸残基上的磷酸化能通过抗磷酸酪氨酸的抗体来检测。直接从未标记的细胞中通过免疫沉淀抗原可以检测其酪氨酸磷酸化，通过SDS-PAGE将免疫沉淀的蛋白质分离，使用常规的免疫印迹法转移到硝酸纤维素膜上。使用磷酸化酪氨酸的特异性抗体进行免疫印迹。

    糖基化

    在研究蛋白质的糖基化时，使用特异性抗体通过免疫沉淀相应的抗原是极为有用的方法。当蛋白质在SDS-PAGE中迁移时，首先要注意的就是糖基化。免疫沉淀下来的蛋白质如果被糖基化，则计算出的分子质量就比预计的大30％～50％，而且条带会变宽。糖基化对细胞有多种作用，但主要是作为蛋白质转运的特殊步骤中的标记蛋白，蛋白质的结构改变可导致其活性改变。或提供细胞外的结合区，从而对细胞内的信号传导及组织发育发挥作用。

    按照与多肽连接的不同可将糖基化分为两种形式。N端糖基化通常将一个糖基，几乎都是N—乙酰半乳糖胺，与天冬酰胺的氨基基团相连，O端糖基化可将多种糖与丝氨酸的羟基相连。蛋白质很少被单个糖基修饰。糖基化难以研究的原因在于糖链上有许多不同的糖基，多糖骨架中糖基的顺序也不同，而且侧链的延伸与分支存在多样性。

    研究蛋白质的糖基化有两种常用的方法：①以放射性单糖标记细胞，使其被摄取后加在糖骨架上；②以特异性的化学试剂或酶裂解成分处理纯化的多肽，去除部分或全部的糖基。特异性抗体有助于两种过程的实施。在标记的单糖发挥作用之后，将蛋白质沉淀并通过SDS-PAGE分离，然后检测其放射活性。掺有[³²S]标记的蛋氨酸或其他氨基酸的蛋白质可进行免疫沉淀，然后以化学的或酶裂解成分处理或不加处理，通过SDS-PAGE分离后检测活性的改变。活细胞用[³H]半乳糖或[³H]甘露糖进行放射标记，标记时间应较短，不超过1h，因为多糖可很快参与多种不同的生物合成途径，含糖复合物以外的其他大分子中也可标记。断裂也是问题，因为没有简单的方法可破坏所有的糖基化或全部的N端糖基化或O端糖基化。多肽—N糖基酶F常被用来裂解N端糖基，它可以断裂大部分的N端糖基。其他常用的酶包括内源性糖苷酶H和内源性糖苷酶F。尽管从技术上讲化学裂解较为复杂，但许多研究者认为一旦在实验室建立该方法，便更可靠有效。zui常用的化学裂解物是无水氟甲噻嗪。如需获得上述问题更详细的资料，读者可参阅Vavki（1994）的放射标记法和细胞生物学新进展。

    烯化

    已知细胞中0．1％一0．5％的蛋白质可加上类异戊二烯进行修饰。用作蛋白质修饰的类异戊二烯有farnesyl和geranylgeranyl基团。这些疏水性成分常用来将蛋白质锚着在脂质膜上。常修饰的是羧基端的半胱氨酸残基，通过巯基酯相连。

    采用[³H]代谢标记类异戊二烯的前体物甲羟戊酸（mevalonate）可检测烯化，有4种不同的标记方法可供选择。早期实验采用在相对低水平的结合培养基中加入高水平[3H]—甲羟戊酸（>500uCi／m1）。阻断甲羟戊酸的内源性合成有助于其掺入。在细胞内HMGCoA在HMGCoA还原酶的作用下，生成甲羟戊酸。在代谢标记实验中，抑制HMGCoA还原酶，可减慢此合成反应，增加[3H]—甲羟戊酸掺入到farnesyl和geranylgeranyl基团的前体物中的量。HMGCoA还原酶的特异性药物（mevinnolin）使此步得以实施。第三种变化是增加甲羟戊酸的转运率，甲羟戊酸的转运体zui近已被克隆，并且可转入待检测的细胞中。此外，少数细胞系具有选择性高水平转运能力，  目的基因可转染这些细胞来研究烯化作用。

    硫酸化

    许多细胞外蛋白可通过加入硫酸后被修饰，zui有特点的是葡萄糖氨基酸多糖（glycosaminoglycans），如肝素硫蛋白多糖和粒素（granins）。将生长的细胞置于含有[³⁵S]标记的硫酸，而不含未标记硫酸盐（MgCl₂取代MgS0₄）的少量培养基中，可以检测硫酸化过程。如果需要加入血清，用透析和双重滤过除菌的样本去除培养基中的硫酸。放射性标记硫酸盐的终浓度应接近0．5uCi／m1。标记时间应该比肽链延长的时间稍短。对于仍处于分泌途径中的蛋白质，标记时间不应超过5min，对已分泌的蛋白质和胞外的基质蛋白，通常要孵育标记30～60min。

分泌蛋白可直接从培养基中通过免疫沉淀进行标记，胞内蛋白在洗涤细胞和用裂解缓冲液处理后可释放出来，然后采用常规的标记方法进行免疫沉淀。通过放射自显影或磷光成像仪检测SDS-PAGE上硫标记的蛋白质。