一旦果蝇类标本被固定及透化处理后，便可加入抗体。如同其他免疫组化技术，可直接使用标记一抗，或者通过标记的二级试剂（能与一抗特异性结合）进行检测。一般而言，直接标记一抗产生的信号更为清晰，背景较低。但其主要不足之处是如检测多种抗原，就需分别制备和纯化相应的多种标记一抗。因此，除了特殊情况以外，一般推荐使用间接法，该法所需的二级检测试剂可以购自经销商。
在大多数情况下推荐用酶标试剂，因其敏感度较高，使用普通的光学显微镜就可以观察结果，如前所述。本节主要介绍荧光染料标记试剂的使用。如需要高分辨率或同时定位两种抗原时推荐使用此法。荧光染料标记的检测需要荧光显微镜或共聚焦显微镜。
在抗原制备过程中研究者常采用几种方法固定果蝇类标本，这就使得抗原经受的处理更为强烈，通常会遇到较高背景的问题。在果蝇类标本的免疫组化染色中，为消除较高背景可将样本与正常羊血清预先孵育。大部分标记二抗试剂是羊抗鼠或羊抗兔免疫球蛋白抗体。因而，选用非免疫羊的天然抗体来封闭非特异交互反应性位点，从而降低背景。此外，通过降低抗体浓度并孵育过夜亦可降低背景。
1．对照
特异性染色反应需要与对照进行比较。为了准确评价染色模式，应对来自同一种属的两种抗体进行比较。对于多克隆抗体来说，的对照是从用于制备特异性抗体的同一动物免疫前采集的血清，但已可以使用来自同种动物的非免疫血清。对于单克隆抗体来说，对照应该是与特异性抗体的来源相同；例如，杂交瘤细胞培养上清对比上清，小鼠腹水对比腹水，纯化抗体对比纯化抗体。对照抗体应该与特异性抗体的类和亚类相同。来自亲代骨髓瘤的细胞培养上清不宜作为对照，因其中不含抗体。适宜的对照杂交瘤细胞株可从美国ATCC或欧洲动物细胞培养保藏中心获得。此外，对二级试剂亦应进行检测。
2．准备工作
进行抗体结合和检测zui重要的准备工作是进行一抗和二抗的滴度测定。虽然在下述方法中建议抗体的加入初始量，但在免疫染色中应调整一抗、二抗的用量，以便达到足以引起强大有效信号的zui低浓度，以免发生非特异性染色。对每一种抗体（存在于蛋白缓冲液中，如1％IgG／PBS）做一系列稀释并观察其对靶细胞的染色效应。1／3稀释（1份抗体中加入2份缓冲液）将接近其半对数值，并对所加入量进行合适的快速测定。对于*抗体的每一个滴度测定应进行重复实验。而二抗一旦确定其稀释度，就可以作为该批抗体的标准用量。如有可能，应该对携带所研究抗原基因缺失的果蝇类标本同时进行染色。这将为特异性抗体提供一个*的遗传对照。
3．所需溶液与试剂
*抗体溶液；第二抗体（多数来自商品试剂）；PBS；含1％正常羊IgG的PBS。
4．特殊设备
荧光显微镜或共聚焦显微镜。
