差速离心分离植物（动物）细胞核

线粒体和细胞核的制备与观察

利用细胞核与线粒体在一定介质中的沉降速度的差异，可采取分级差速离心的方法，将细胞核与线粒体逐级分离出来。（差速离心技术）

线粒体是真核细胞*的进行能量转换的重要细胞器。将动植物组织制成匀浆，在适当的悬浮介质中差速离心法可以分离细胞线粒体。在一定的离心场中（选用离心机的一定转速），球心颗粒的沉降速度取决于它的密度、半径和悬浮介质的黏度。在一均匀的悬浮介质中离心一定时间，组织匀浆中的各种细胞器及其它内含物由于沉降速度不同将停留在高低不同的位置。依次增加离心力和离心时间，就能够使这些颗粒按其大小、轻重分批沉降在离心管底部，从而分批收集。细胞器沉降先后顺序先后是细胞核、线粒体、溶酶体和其他微体、核糖体和大分子。

悬浮介质通常采用缓冲的蔗糖溶液，它较接近细胞质的分散相，在一定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性；pH7.2的条件下，亚细胞组分不容易聚集成团，有利于分离。整个操作过程样品要保持在0℃~4℃，避免酶失活。

细胞器标记酶的测定是评价细胞器内膜组分和分离纯度的主要依据，如线粒体内膜上分布有细胞色素氧化酶，该酶使詹纳斯绿B染料保持在氧化状态呈现蓝绿色，从而使线粒体显色，而胞质中的染料被还原成无色。

詹纳斯绿B是一种活体染料，能对动植物的细胞或组织在活体状态下进行无毒害的染色。由于染料（碱性染料）的胶粒表面带有阳离子，酸性染料的胶粒表面带有阴离子，而被染部分本身具有阳离子或阴离子，这样，它们彼此之间发生吸引作用，染料就被堆积下来。染色法可以显示出活细胞内的某种天然结构存在的真实性，而不影响细胞的生命活动和产生任何物理、化学变化以引致细胞的死亡。

Gimesa是一种复合染料，即为酸性染料与碱性染料的结合物。在水溶液中电离为带正电和负电的染料离子。

***材料： 鼠肝脏， 猪肝脏

***试剂：
　　（1）0.25mol/L蔗糖-0.01mol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris）-盐酸缓冲液（pH7.4）
　　0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷溶液10ml
　　0.1mol/L盐酸8.4ml
　　加双蒸水到100ml，再加蔗糖使浓度为0.2mol/L

（2） 0.34mol/L蔗糖-0.01mol/LTris-盐酸缓冲液（pH7.4），配法同上。

（3） 1%詹纳斯绿B（Janus green 染液，称取50mg（pH7.4），詹纳斯绿B溶于5ml生理盐水中，稍微加热使之溶解后，过滤，即为1%原液。

（4） 姬姆萨染液（Giemsa）：称取姬姆萨粉0.5g，甘油33 ml 、纯甲醇33ml。先在姬姆萨粉中添加少量甘油，然后在研钵内研磨至无颗粒状，再将剩余甘油倒入混匀，56℃左右保温2h使其充分溶解，zui后加甲醇混匀，成为姬姆萨原液，保存于棕色瓶。使用时吸出少量，用1/5mol/L磷酸缓冲液作10~20倍稀释。

（5） 1/15 mol/L磷酸缓冲液?（pH6.8）
　　1/15 mol/ L磷酸二氢钾 （KH2PO4）50 ml
　　1/15 mol/ L磷酸氢二钠（Na2HPO4） 50 ml

卡诺（Cornay）固定液：无水乙醇 6 ml 冰醋酸 1 ml 氯仿 3 ml