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奶粉中双氰胺的检测方法 （HPLC-UV和HPLC-MS/MS法）

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2013/1/27 12:28:05

北京时间1月25日凌晨消息，新西兰牛奶中发现了有害物质——双氰胺。双氰胺又名二氰二胺，缩写DICY或DCD。虽然标准未对食品中的双氰胺*，但高剂量的双氰胺对人体是有毒的。
本文采用天津博纳艾杰尔科技的Cleanert® MAS-QuChERS-双氰胺净化管和Venusil® HILIC液相色谱柱，建立了奶粉中双氰胺的MAS-QuEChERS快速前处理方法和LC-UV以及LC-MS/MS检测方法。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料
液相色谱仪，涡旋振荡器，超声波清洗机，氮吹仪。
双氰胺标准品（CAS： 461-58-5；FW=84.08），Cleanert® MAS-QuChERS-双氰胺净化管，Venusil® HILIC液相色谱柱，微孔滤膜，乙酸铵、乙酸、乙腈为色谱纯，实验用水为超纯水。

1.2 实验步骤
提取、净化：称取1g试样于50mL具塞离心管中，加入2mL水溶解后，加乙腈定容至10mL，超声10min，8000r/min离心5min，取2mL上清液加入Cleanert® MAS-QuChERS-双氰胺净化管填料，涡旋0.5min，8000r/min离心5min，取上清液过0.22µm滤膜，待测。

1.3　实验条件
1.3.1液相色谱法（HPLC法）：
色谱柱：Venusil® HILIC（5μm，100Å，4.6*250mm）；
流动相： 10mmol/L乙酸铵（pH=4.0）：乙腈=10: 90；
波长：220nm；进样量：10µl；柱温：30℃；流速：1mL/min。
1.3.2 LC-MS/MS法：
（1）色谱条件：
色谱柱：Venusil® HILIC（ 5μm，100Å，2.1*150mm）；
流动相： 0.5mmol/L乙酸铵（pH=4.0）：乙腈=10:90；进样量：10µL；柱温：30℃；流速：0.2 mL/min。
（2）质谱条件：
质谱仪：API 4000+；离子源：电喷雾离子源；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测；CAD：8.00；CUR：10.00；GS1：60.00；GS2：50.00；IS：5500.00；TEM：500.00。

表1双氰胺质谱信息

药物名称 监测离子对 DP EP CE CXP
双氰胺 85.1/68.1 71 10 41 6
  85.1/43.1 71 10 41 6

注：带“____”的监测离子对为定量离子对。


2.结果与讨论

2.1 液相色谱法：

2.1.1线性关系和检出限
准确称取双氰胺标准品50mg于50mL容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，作为标准贮备液；
分别量取一定量的标准贮备液，用乙腈稀释，配置成浓度为0.1µg/mL，0.5µg/mL，1.0µg/mL，2.0µg/mL，5.0µg/mL和10.0µg/mL的标准溶液，按照上述色谱条件，依次进样检测。以标准溶液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，拟合线性方程，结果见表2：
表2 双氰胺线性方程和定量限（HPLC法）
名称 保留时间 线性方程 相关系数 zui低定量限（S/N=10）
双氰胺 4.92min Y=116.44X+3.2699 0.9997 0.1µg/ml

2.1.2检测方法稳定性考察
选用10.0µg/mL的标准溶液连续进样6针，计算其保留时间和峰面积的RSD值，结果见表3：
表3 检测方法定性和定量稳定性考察考察（HPLC法）
标号 保留时间/ min 峰面积
1 4.930 1061.7
2 4.933 1072.2
3 4.930 1064.4
4 4.929 1079.7
5 4.930 1067.3
6 4.934 1073.6
RSD，% 0.04 0.62

2.1.3准确度和精密度
选取市售某品牌奶粉试样，进行添加回收实验，结果见表4
表4 10µg/g添加回收实验结果（HPLC法）
平行1，% 平行2，% 平行3，% 平均值，% RSD，%
98.6 88.4 89.8 92.3 5.99

 


2.2 LC-MS/MS法

2.2.1线性关系和检出限
准确称取双氰胺标准品50mg于50mL容量瓶中，加水溶液并稀释至刻度，作为标准贮备液。
分别量取一定量的标准贮备液，用乙腈稀释，配置成浓度为5ng/mL，10ng/mL，20ng/mL，50ng/mL，100ng/mL和500ng/mL的标准溶液，按照上述液质方法，依次进样检测。以标准溶液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，拟合线性方程，结果见下表5：

表5 双氰胺线性方程和定量限（LC-MS/MS法）
名称 保留时间 线性方程 相关系数 zui低定量限（S/N=10）
双氰胺 3.15min Y=8777.2X+7435.9 0.9993 5ng/mL

2.2.2 检测方法稳定性考察
选用50.0ng/mL的标准溶液连续进样6针，计算其保留时间和峰面积的RSD值，结果见表6：
表6 检测方法定性和定量稳定性考察考察（LC-MS/MS法）
标号 保留时间，min 峰面积
1 3.29 382950
2 3.30 387950
3 3.25 382840
4 3.31 399820
5 3.30 378580
6 3.30 383810
RSD，% 0.65 1.92

2.2.3准确度和精密度
选取市售某品牌奶粉试样，进行添加回收实验，结果见表7。采用空白样品稀释法判断检测方法的基质效应影响。空白净化液稀释和乙腈稀释的标准溶液，双氰胺峰面积和相对丰度比无明显变化，故判断该方法无基质效应的影响。
表7 100ng/g添加回收实验结果
平行1 平行2 平行3 平均值 RSD
84.6% 80.7% 90.2% 85.2% 5.61%

3 产品订货信息

产品名称 规格型号 货号
MAS-QuChERS-双氰胺净化管 100mg/2mL，50支/包 MS-SQA01
Venusil HILIC液相色谱柱 4.6*250mm，5μm，100Å VH952505-0
2.1*150mm，5μm，100Å VH951502-0
微孔滤膜 0.22μm，直径13mm, 200/Pk AM021320
双氰胺对照品 500mg /瓶，含量≥99.0% DCD001
1g /瓶，含量≥99.0% DCD002
离心管 50mL，带螺纹盖，25个/包 LXG0050
一次性无菌注射器 5mL,100/pk ZSQ-5ML

 

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