DNA合成：你应该知道的秘密[创新技巧]

说起DNA合成，几位前辈师兄师姐们犹会提起上世纪90年代世行贷款买仪器，好些单位甚至医院都赶时髦买了DNA合成仪，买回来才发现自己那点合成需求和费用，委实买得起用不起，那昂贵的设备成了摆设。彼时国外DNA合成虽然质量好纯度高，可寄回来海关不好过，时间上实在伤不起，幸亏国内迅速崛起的几家DNA定制合成供应商，以到货速度快和价格优势渐渐占据了低端市场，对于实验室来说，DNA定制合成于是变成了发传真+等收货那么简单的事。
也没那么简单。DNA化学合成固有的错误率较高，片段越长越是如此，挑选序列正确的克隆所花费的时间和金钱比DNA合成要多去了。挑克隆着实花费了无数学生们的不少好时光。所以，大家的选择标准也从价格渐渐回归到质量。各厂家之间，从过去拼价格，拼速度，到如今，拼的是纯化质量了。不纯化，PAGE纯化，HPLC纯化，到反相纯化，有多大区别？纯化过的DNA oligo是不就去除了全部错误序列呢？我们得先从DNA合成的错误成因谈起：
1. 内部缺失（n-1，n-2 etc）产物。这是化学合成DNAzui普遍与zui主要的限制因素，且不能通过纯化DNA oligo来解决这个问题。化学合成DNA不及活细胞内DNA复制具有高保真性，在活细胞内，存在大量的校正与修复系统，将碱基突变率降低至1/（1×106）以下。PCR反应也具有较高的保真度，例如：错误率在1/1000——1/10000，并且还可通过DNA 聚合酶的性能提高保真度。但是化学合成DNA不同，每单个合成循环的错误率约为1/100，随碱基数目增加而增加。其原因包括：
（1）DNA oligo的化学合成是碱基与碱基之间通过化学反应偶联而成，而化学反应的偶联效率一般在99%左右，也就是说，在每次进行偶联反应时，都会有1%的DNA段附加不上新的碱基，对这种截断的失败序列，为了防止其参与后续的偶联反应，采用CapA与CapB进行化学封闭，以阻断其延伸，但化学封闭反应的效率不可能达到100%。导致出现合成失败的DNA段或截断序列残留在合成的DNA粗制品中。
（2）DNA oligo的不*脱保护。寡核苷酸的*脱保护包括从磷酸酯基团、碱基上的环外氨基和5′-OH部分上去掉保护基团。脱保护的化学反应效率不可能达到100%，未脱保护的碱基无法参加偶联反应而导致DNA oligo内部缺失碱基。
（3）不断延长的DNA链与不断累积的副产物会干扰DNA oligo的化学合成。
对于以上三方面问题，至今为止还没有找到一个的解决方案。因为延长盖帽时间也不能保证封闭反应效率达到100%；而对于脱保护反应来说，增加脱保护试剂量及延长脱保护时间又会导致DNA oligo脱嘌呤。因此只能采取折衷方法将不*脱保护与脱嘌呤同时控制在低水平上。内部缺失碱基的截断序列绝不可能100%去除干净，对于几种纯化方法来说，OPC或HPLC不可能去除内部缺失碱基的截断序列，的方法是通过PAGE纯化降低截断序列数量。
2.　单核苷酸的插入是存在于目的DNA oligo产物中的另一种常见的序列错误。
当同一DNA oligo分子中存在G-偶联或单碱基插入（n+1）同时又存在单碱基缺失（n-1）时，此条DNA oligo的长度与目的DNA分子的长度相同，因此无法通过OPC 、HPLC或PAGE纯化将此“失败序列”去除。 DNA oligo化学合成存在的这些弊端曾被Hecker KH与Rill R报道过（Error analysis of chemically synthesized polynucleotides.　Biotechniques，1998 Feb；24：256-260）。在这篇文章中，作者合成并PAGE纯化了长链DNA oligo，用它们进行PCR克隆，然后测序鉴定了10个克隆，发现存在7个单碱基缺失，一个连续的4个碱基缺失，一个G-C替换。除了这些碱基错误，其它学者还曾报道存在G-偶联、分支及其n+x产物。
为了解决上述碱基出错的问题，首先要优化化学合成方法来提高DNA oligo的纯度，并且对DNA oligo粗制品进行纯化，虽然无论哪种纯化方式都不能保证去除错误序列，但能改善产品的纯度，进而提高实验的成功率。Oligo的纯化方式zui常见的有脱盐、OPC、PAGE和HPLC。脱盐只能去除氨、盐等杂质，而不能有效去除合成过程中产生的短片段，因此一般只能用于普通的PCR反应和测序。HPLC和PAGE纯化得到的纯度很高，但只能进行手工操作，相当费时费力。OPC不仅能去除短片段，当DNA oligo的长度在40 bases以内，其纯度与HPLC或PAGE纯化的纯度相当，而且由于简便、快捷，能进行高通量（high-throughput）和自动化（automation）操作，因而受到很多DNA合成公司的青睐。
但OPC纯化也有一个缺点，就是在操作过程中需要一种弱酸脱掉DMT基团，而DNA Oligo在酸性条件下容易脱嘌呤（depurination）。对于脱嘌呤后的碱基，DNA聚合酶不能识别，可能导致PCR扩增后出现碱基缺失或错配。因此，有些公司不推荐OPC纯化用于克隆、突变、基因合成等实验。
一般来说，不同厂家的合成方法其实并没有什么大的本质的区别，只是有一些经验的积累和技巧。比如脱保护剂浓度的选择很重要，太低脱保护不*，太高又增加脱嘌呤的机率，还有如何优化程序，使盖帽更充分、更*等等…。纯化方式的选择，一般说来修饰标记要用HPLC纯化，长链要用PAGE 纯化，但这两种纯化方式都非常费时耗力。
赛百盛近期对OPC纯化技术进行了改进，在此基础上建立了一种基于DMT-on的纯化技术——QPC纯化，终于解决了这一令人困扰的难题。QPC纯化选用了一种比较温和的酸脱保护，经反应优化，既保证了脱保护*，又尽量降低了脱嘌呤的风险，DNA Oligos正确率较高，特别适合量大、用于克隆、定点突变、基因合成等实验的DNA合成纯化。
研究结果表明，OPC纯化的DNA oligo脱嘌呤的发生率zui高时可达30%，而QPC纯化的脱嘌呤发生率不到3%。因此用QPC纯化的DNA oligo出错率大大减少，对于长度在60 bases以内的Oligo的纯化效果也很好。经全基因合成验证，赛百盛公司自动纯化（QPC纯化）的DNA oligo正确率较高。合成长度约1kb的基因，从8个克隆中可以挑选到5个左右*正确的基因序列，因此QPC纯化的Oligo适用于克隆、定点突变、基因合成等实验。了解这些事实，有助于你做出适合自己的选择。虽然合成DNA oligo出错的风险无法避免，实际操作中挑到正确克隆的可能性还是很大——但别忘了多挑几个克隆！ 
 
降低出错的建议包括：
（1）对DNA oligo合成产物进行纯化。
（2）建议多挑几个克隆（而不仅仅是一个或两个克隆），一般情况下会挑到正确的克隆。
（3）减少转化后预温育时间（未加抗生素）。因为在未加抗生素情况下，延长温育时间可能会导致单个突变克隆的扩增。
（4）挑克隆时，应挑选分隔良好、新鲜的、不太大的单菌落。
（5）尽可能选择合成短的Oligo而避免合成长度大于60 bases的Oligo，实在要合成长序列，时间充裕的话选择国外合成。