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广州中医药大学学报 2000年第2期第17卷 老年性痴呆防治研究

作者：胡镜清　温泽淮　赖世隆

单位：广州中医药大学老年脑病研究所，广州　510405

关键词：@Morris水迷宫；记忆；数据说明；统计

　　摘要：Morris水迷宫是检测动物记忆水平的重要工具，结合应用Morris水迷宫开展对老年性痴呆防治研究的实践体会，探讨了Morris水迷宫所检测的记忆属性、检测程序和数据统计方法。提出在Morris水迷宫中检测到的可能是实验动物的一种长时的陈述性记忆，故强调在数据统计中应注意采取重复测量数据的统计方法进行分析。

　　中图分类号：R338.64　　　文献标识码：A

　　文章编号：1007-3213（2000）02-0117-03

　　随着学习记忆脑机制研究的不断深入以及寻找有效防治认知障碍类疾病方法的需要，客观准确地评价实验动物的学习记忆水平已经成为神经生物学和神经药理学中非常重要的研究内容。我们在研究老年性痴呆的过程中，认为Morris水迷宫可作为检测实验动物学习记忆水平的重要工具。为此，我们想就Morris水迷宫所检测的记忆属性和有关的方法学问题作一初步的探讨。

　　1　Morris水迷宫检测程序和记忆属性

　　学习记忆是脑的神经生理活动。学习是指接受外界环境信息而影响自身行为的过程，记忆则是指获得的信息或经验在脑内储存、加工和提取的过程。学习记忆既是认知活动中的重要方面，也是智力结构中的重要要素。近年来，随着学习记忆本质内容研究的不断深入，特别是“层次性多重记忆系统”理论的建立［1，2］，*地改变了学习记忆的研究进程和研究方向。也使得过去对记忆的分类有了更深刻的内涵。例如瞬时记忆、短时记忆和长时记忆，外显性记忆和内隐性记忆（或程序性记忆和陈述性记忆）等的划分，不再仅仅是学习记忆表现形式上的不同，而且更重要的是它们可能分属不同的记忆系统，存在着不同的信息加工和提取方式，涉及不同的神经机制。只有在讨论某一特定记忆系统中某一具体学习记忆过程时，研究它的机制才有意义。

　　Morris水迷宫是英国心理学家Morris于20世纪80年代初设计并应用于学习记忆脑机制研究的［3］。它包括一个盛有水的圆形水池、隐藏在水面下的平台以及一套图象自动采集和处理系统（摄像机、录像机、显示器和分析软件等）。此后，该迷宫系统被广泛运用在神经生物学领域的基础和应用研究中，实验动物主要是大鼠。较为经典的Morris水迷宫测试程序主要包括定位航行试验和空间探索试验两个部分。其中定位航行试验（place navigation）历时数天，每天将大鼠面向池壁分别从4个入水点放入水中若干次，记录其寻找到隐藏在水面下平台的时间（逃避潜伏期，escape latency）。空间探索试验（spatial probe）是在定位航行试验后去除平台，然后任选一个入水点将大鼠放入水池中，记录其在一定时间内的游泳轨迹，考察大鼠对原平台的记忆。实验可供分析的参数较多，包括逃避潜伏期、各象限游泳距离、原平台象限游泳距离与总距离之比、原平台象限游泳时间与总时间之比、平台偏离角、40cm穿环时间、跨平台次数以及中、外环游泳距离百分比等。

　　经典的Morris水迷宫所检测的是大鼠在多次的训练中，学会寻找固定位置的隐蔽平台，形成稳定的空间位置认知，这种空间认知是加工空间信息（外部线索）形成的。平台的位置与大鼠自身所处的位置和状态无关，是一种以异我为参照点的参考认知（allocentric cognition），所形成的记忆是一种空间参考记忆（reference memory）。从信息的加工和提取方式来看，这种空间参考记忆进入意识系统，其储存的机制主要涉及边缘系统（如海马）以及大脑皮层有关脑区，常伴有Hebb突触修饰［3，4］，应该属于陈述性记忆（declarative memory）。而临床健忘和痴呆的病人，正是陈述性记忆首先受损而且比较突出［5］。所以从检测的记忆属性来说，运用Morris水迷宫来进行防治此类疾病有效药物的筛选研究是比较恰当的。

　　任何一种学习记忆的检测工具所检测的学习记忆类型，可以随着检测程序的变化而不同。Frick等对经典的Morris水迷宫检测程序进行了完善［6］。他们在用固定位置平台测试大鼠空间参考记忆之后，再将平台的位置改为不固定，进一步检测大鼠的工作记忆（working memory）能力。显然，寻找不固定平台的认知过程要复杂一些，需要大鼠对时间以及空间上分离的信息加以整合和判断。Olton等设计的八等臂迷宫检测程序中也提出了类似的概念［7］。值得注意的是，很多时候参考记忆和工作记忆的变化可以是不同步的。Frick的研究提示，大鼠在17月龄之后始出现参考记忆受损，大鼠的工作记忆则要在24月龄才较青年组有明显改变［6］。我们的研究结果亦证实15月龄的大鼠参考记忆与青年大鼠比较并无明显减退（如图1），青年组和15月龄初老年组多因素方差分析比较，差异无显著性（P＞0.05）。

　　2　Morris水迷宫检测方法与统计分析

　　所有Morris水迷宫的基本实验程序和方法都是相似的，方法上的不同可能对结果有重要影响的主要是在检测时限和数据的统计分析上，就此结合自己的实验结果谈谈我们的看法。

　　2.1　实验环境要求　在Morris水迷宫测试中，实验环境对结果影响较大的主要是迷宫周围的物品甚至挂物所提供的空间线索必须保持固定不变，即认知的“参照系”要一致。这里面zui容易被忽视的是实验者在实验过程中所处的位置，因为实验者如果在实验动物视野之内的话，也就自然成了实验动物所记忆的参照物之一。假如在实验过程中，实验者经常变换位置或不停地走动，对实验结果自然会有较大的影响。其次，在我们的实验中还观察到，迷宫的水温也是影响实验动物的“逃避动机”进而影响实验结果的重要因素。大致上来说，水温应该略低，而且在实验期间应尽量保持恒定。 另外，在实验过程中保持安静及光线的一致也是很重要的。除此之外，很多研究者还强调应该在迷宫的水中加入牛奶等使之浑浊，以帮助隐藏水面下的平台。但从我们的实验结果来看，不加入牛奶对实验结果并无影响，这可能与隐藏平台低于水面1～2cm，而大鼠在游泳逃避时总是抬起头部（避免水淹）有关。

　　2.2　检测时间　Morris水迷宫测试的周期往往根据实验要求来确定，一般为7～15d。目前的主要问题是在定位航行试验中允许实验动物寻找平台的zui大时限取多少（即zui大潜伏期）合适。现在有的取120s，有的取180s，zui近的文献报告则以60s居多［6］。但究竟取多少合适，大都是实验者根据个人的经验来确定，并无统计学的结果支持。据我们的初步统计结果显示，大鼠在60～120s之间能够找到隐藏平台的次数差异大约只占其找到平台总次数的5%，这在统计学上，可以看作是“小概率事件”。也就是说，大鼠在60s内找不到隐藏平台的话，再延长到120s也很难找到。从这一点考虑，似乎zui大潜伏期取60s可以节约实验时间。但问题并非如此简单 ，由于在统计时，很多研究将zui大潜伏期直接纳入统计，显然，zui大潜伏期的不同将不可避免地影响统计结果。所以从统计学上了解不同的zui大潜伏期到底对Morris水迷宫实验结果有多大的影响，如何避免因此带来的系统误差等问题尚有待进一步研究。

图1　不同组大鼠每天平均逃避潜伏期变化

　　2.3　统计分析　Morris水迷宫的实验数据较为复杂，其统计分析难度也较大，尤其是对大鼠在定位航行中所测得的逃避潜伏期如何进行统计学分析既往存在的问题较多。在过去的研究中，有的直接计算每天的平均逃避潜伏期后再进行t检验或方差分析，或根据大鼠的逃避潜伏期在定位航行试验后3d趋于稳定的情况，仅对后3d的平均逃避潜伏期进行t检验或方差分析。有的研究则就1～5d的逃避潜伏期进行单因素方差分析。我们认为以上统计方法均不正确。一个较明显的错误是，以趋于平稳的后3d的平均逃避潜伏期代表记忆水平，首先遇到的问题是仅在生理状态下的大鼠才表现如此，而实验记忆损伤组大鼠往往后3d的逃避潜伏期仍然持续下降。如图1所示，正常青年组和初老年组大鼠的逃避潜伏期在后3d趋于平稳，但实验损伤组大鼠的逃避潜伏期由于学习记忆损伤后其基线较高，第3～5天逃避潜伏期仍然呈下降的趋势，并不象正常对照组一样趋于稳定。不仅如此，还存在上述统计方法对定位航行试验中测得的逃避潜伏期数据统计学特征的认识错误。定位航行试验中的逃避潜伏期具有以下特点：①系重复测量设计，即在给予某种处理后，在不同的时间点上从同一受试对象上重复测量获得的数据（逃避潜伏期）；②影响逃避潜伏期（自变量）统计分析结果的至少有动物组别、检测时点等多个效应因子（effective factor），效应因子之间存在交互影响效应；③同一受试动物的不同时间点所测得的逃避潜伏期存在高度的自相关性；④存在截尾数据（zui大潜伏期）。据此，我们认为对Morris水迷宫中定位航行试验的逃避潜伏期应采用重复测量数据的多因素方差分析结合截尾数据的生存分析方法较为恰当［8，9］。

　　3　Morris水迷宫的应用和评价

　　目前，Morris水迷宫主要应用在学习记忆的神经生物学机制探讨和神经药理（包括中药药理）的研究。与过去的水迷宫及跳台、避暗等检测工具相比，其主要的优点包括：能提供较多的实验参数，系统全面地考察实验动物空间认知加工的过程，客观地反映其认知水平；将实验动物的学习记忆障碍和感觉、运动缺陷等分离开来，减少它们对学习记忆过程检测的干扰；操作简便，数据误差较小。不足之处是实验程序的设计需要考虑的因素较多，需要实验者具备一定的神经生物学、认知心理学和数理统计方面的知识；其次，统计分析较为复杂。

　　作者简介：*作者，胡镜清　男，1965年出生，讲师，医学博士

　　参考文献：

　　［1］梁宝星.记忆的耗散结构模式［J］.思维科学通讯，1991，2：34

　　［2］吴敏，杨治良.试论内隐记忆的性质和理论解释［J］.心理学动态，1994，2（1）：1

　　［3］Morris R G M,Garrud P,Rawlins J N P,et al.Place navigation impaired in rats with hippocampal lesions［J］.Nature,1982,297:681

　　［4］Lisman J.A mechanism for the Hebb and anti_Hebb processes underlying learing and memory［J］.Proc Natl Acad Sci USA， 1989,86:9574

　　［5］Squire LR,Zola_Morgan S.Memory,brain system and behavior［J］.Trends in Neuroscience,1988,11:170

　　［6］Frick K M,Baxter M G,Markowaska A L, et al.Age_related spatial reference and working memory deficits assessed in the water maze［J］.Neurobiology of Aging,1995,16（2）:149

　　［7］Olton D S,Papas B C.Spatial memory and hippocampal function［J］.Neuropsychol,1979,17（6）:669

　　［8］陈长生，徐勇勇，曹秀堂.医学研究中重复观测数据的统计分析方法［J］.中国卫生统计，1996，13（6）：55

　　［9］胡良平，代炼忠，郭秀花，等.现代统计学与SAS应用［M］.北京：军事医学科学出版社,1996.129