17β-雌二醇对原代培养大鼠肝星状细胞影响作用实验研究
肝纤维化是一个多因素和多种细胞参与的慢性肝病的共同病理特征，导致ECM过度沉积，是肝硬化的必经阶段。HSC表型激活与增殖是肝纤维化形成过程中的一个关键病理过程，因而HSC成为抗肝纤维化治疗的主要靶细胞。HSC活化后除可分泌大量ECM外，还表达Desmin，α-Actin、α-SMA等平滑肌细胞标志物，具有肌细胞收缩特性，直接参与了PVH的发生。在肝纤维化形成过程中，LN和IV型胶原在Disse间隙表达增加，参与了肝窦毛细血管化（sinusoid capillarization）及其BM的形成。肝窦毛细血管化是指SEC与肝细胞之间出现一层BM的病理改变，伴有SEC窗孔消失，使肝窦成为类似毛细血管样的管道结构，它与门脉高压的形成密切相关，是肝纤维化的特征性病理改变。肝窦毛细血管化在肝纤维化/肝硬化的发生发展及肝功能衰竭的不断进展中具有非常重要的意义。近年来，随着细胞生物学和分子生物学技术在肝硬化研究中的应用，肝窦毛细血管化在肝硬化PVH形成和肝功能衰竭中的作用研究越来越受到重视。在PVH发病机制方面，HSC活化与增殖、肝窦毛细血管化和血管活性物质如NO、ET-1等成为研究的热点。雌激素可能在调节ECM如I型胶原分泌和一些细胞因子如TGF-β、NF-kB等基因的表达中起一定作用。
本课题是杭州市重点专科专病项目（项目编号：2004433Q09）。本课题通过原代培养大鼠HSC、构建大鼠肝纤维化模型，采用电镜、原位杂交等分子生物学方法，探讨了17β-雌二醇对原代培养大鼠HSC、大鼠肝纤维化/肝硬化门脉高压及肝窦毛细血管化的影响作用及其分子生物学机制。研究内容主要包括大鼠肝HSC原代培养和构建了大鼠肝纤维化/肝硬化模型两部分，*部分探讨17β-雌二醇对HSC活化增殖及表型转化、I型胶原分泌以及活化HSC对α-SMA、MMP-1/TIMP-1蛋白表达的影响作用。第二部分通过构建了大鼠肝纤维化/肝硬化模型，应用透射电镜、原位杂交等方法，探讨了E2对大鼠肝纤维化、肝窦毛细血管化及PVH形成的影响作用。大鼠肝组织NF-kB P65mRNA基因表达是HSC活化增殖中重要的信号传导通路，本课题为进一步阐明肝硬化PVH及肝窦毛细血管化的形成机制提供了理论依据。细胞培养部分：实验动物及HSC分离、培养和鉴定：Wistar雄性大鼠，体重足够。首先分离大鼠HSC,灌注Pronase E溶液及IV型胶原酶溶液， Nycodenz分离液混匀，上面覆盖DMEM培养液，进行密度梯度离心。细胞传代培养。扫描电镜观察拍照。采用直接细胞计数法、MTT法、SABC免疫组化染色及ELISA方法，观察17β-雌二醇（E2）对HSC活化与增殖的影响作用和MMP-1及TIMP-1蛋白表达变化。检测细胞培养上清液中I型胶原含量，并作E2细胞毒性试验。动物实验部分：健康Wistar大鼠，以60%CCL4橄榄油剂行腹部皮下注射制备肝纤维化模型。①正常对照组：②CCL4模型组。③E2预防治疗组。随机处理各实验组大鼠，称量体重、观察腹水，测量门静脉直径及门静脉压力（Ppv），记录实验结果。自肝脏右叶取材，取数块肝组织，分别固定于10%甲醛固定液、4%多聚甲醛固定液（含0.1%DEPC）、布宁（Bonin）固定液和2.5%戊二醛固定液中，作免疫组化、原位杂交和透射电镜检查,检测大鼠肝组织中NF-kB P65mRNA基因表达情况。研究发现：17β-雌二醇能抑制HSC活化增殖及表型转化，下调I型胶原表达,增加胶原降解而起到抗大鼠肝纤维化作用。通过构建了大鼠肝纤维化模型、应用原位杂交、免疫组化及电镜技术，发现17β-雌二醇抑制大鼠肝纤维化时LN、IV型胶原蛋白异常高表达，抑制大鼠肝组织NF-kB P65mRNA基因表达，阻断HSC活化增殖信号传导通路而减少ECM分泌与沉积，从而抑制肝纤维化和肝窦毛细血管化，对进一步阐明肝硬化PVH及肝窦毛细血管化形成机制提出了新思路。17β-雌二醇作为一种有效的内源性肝纤维化抑制剂，通过下调NF-kB P65mRNA基因表达，阻断HSC活化增殖信号传导通
