慢性心理应激鼠工作记忆保护

【摘要 】 目的 采用 HSF1基因敲除小鼠模型探讨热休克因子 1及热休克蛋白 （ heat shock p r otein,
HSP）在慢性心理应激中对工作记忆的保护作用。方法 将热休克因子 1 （ heat shock fact or 1）基因野生型
小鼠 （HSF1 + / + ）和热休克因子 1基因敲除小鼠 （HSF12/2 ）暴露于 2个月的慢性心理应激 ,部分小鼠在暴
露于心理应激前给予热休克预处理 , 2个月后采用 T迷宫检测各组小鼠工作记忆 ,western bl ots检测和比较
HSP72, HSP25表达 ,采用单因素方差分析和多因素析因设计方差分析对各组小鼠 T迷宫转换正确数和
HSP72, HSP25表达进行比较。结果 HSF1基因野生型小鼠中 ,慢性心理应激对 T迷宫转换正确数 （8 . 90
± 0 . 46）次与对照组 （9 . 58 ± 0 . 48）次没有明显影响 （ F （1, 65） = 0 . 23, P > 0 . 05） , HSF1基因敲除小鼠中 ,慢
性心理应激引起 T迷宫转换正确数 （4 . 00 ± 0 . 26）次明显低于对照组 （7 . 33 ± 0 . 43）次 , F （1, 65） = 32 . 39, P <
0 . 05）。同时野生型小鼠心理应激后海马组织中 HSP72表达 （1 . 35 ± 0 . 11） , HSP25表达 （1 . 05 ± 0 . 03）明显
高于 HSF1基因敲除小鼠 （ 0 . 23 ±0 . 03 ） , （ 0 . 26 ±0 . 02 ） ,均 P < 0 . 05 ）。热应激也诱导 HSP72 （ 1 . 71
± 0 . 05） , HSP25 （1 . 33 ± 0 . 05）表达增加 ,明显高于 HSF1基因敲除小鼠 [ （0 . 26 ± 0 . 03） , （0 . 23 ± 0 . 08） ,均
P < 0 . 05 ] ,但未发现热应激预处理对 T迷宫转换正确数有影响 （ F （1, 65） = 0 . 32, P > 0 . 05）。结论 HSF1以
及慢性心理应激诱导的 HSP72, HSP25表达 ,在慢性心理应激中对工作记忆具有保护作用。
【关键词 】 工作记忆; 热休克蛋白; 热休克因子 1; 慢性心理应激; T迷宫

长时记忆与工作记忆都与海马有关。慢性社会心
应激可以损伤海马 ,引起海马依赖的长时记忆功能
害[ 1 ]
,但不影响工作记忆[ 2 ]
。急性应激及轻度应激
以引起工作记忆损害[ 3, 4 ]
,其机制与交感神经的激
有关[ 5 ]
。而慢性社会心理应激不引起工作记忆损
害 ,其原因目前尚不清楚。热休克反应和慢性心理应
激都可以激活 HSF1 （ heat shock fact or1, HSF1） ,诱导
热休克蛋白 （ heat shock p rotein, HSP）表达增加 ,包括
HSP72、 HSP25,他们在应激中具有重要的抗应激、 保护
细胞、 维持细胞正常结构和功能的作用。而 HSP表达
对心理应激鼠工作记忆是否具有保护意义目前尚不清楚。因此 ,本研究采用 HSF1野生型小鼠和 HSF1基因
敲除小鼠 ,给予慢性心理应激及热休克预处理 , T迷宫
评定各组小鼠工作记忆 , western bl ots检测 HSP72、
HSP25表达 ,以探讨热休克预处理及慢性心理应激诱导的 HSP表达在心理应激过程中对工作记忆是否具
有保护作用。
材料与方法
一、 动物与分组
本实验动物来自美国德克萨斯大学西南医学实验
中心培育的 HSF1基因敲除杂合子进行繁殖得来的野
生型小鼠 （基因型为: HSF1 + / + ,简称 HSF1 + / +小
鼠 ）和 HSF1基因敲除的纯合子 （基因型为: HSF12/2 ,
简称 HSF12/2 小鼠 ） ,在中南大学湘雅二院动物实验中
心饲养。全价营养饲料 ,光照 8AM～8PM,室温 （24 ±
0 . 5） ℃。
6～7月龄小鼠经行为观察剔除行为表现的
小鼠后 ,共选取 65只进入实验 ,其中 HSF1 + / +小鼠
共 37只 ,随机分为 4组:对照组 （NS组 ） 12只 ,不给予
实验应激;心理应激组 （ PS组 ） 10只 ,给予心理应激;
热休克预处理组 （HS组 ） 6只 ,给予热休克预处理;热
休克预处理加心理应激组 （HS + PS组 ） 9只 ,给予热休
克预处理和心理应激。HSF12/2 小鼠共 28只 ,同样分
为 NS组 12只 , HS组 6只 , PS组 5只, HS + PS组 5
只 ,分别接受与相对应的 HSF1 + / +小鼠各组同样处理。实验过程中死亡的小鼠未记在内。
二、 动物模型制备
1 . 热休克预处理[ 6 ]
:采用自制的加热装置加热 ,
使小鼠肛温达 （40 ± 1） ℃,维持约 15min。热休克预处
理每周 2次 ,于周一和周四给予。
2 . 心理应激:心理应激包括限制应激,高台应激
和旁观电击应激。①限制应激[ 7 ]
:将小鼠置于自制的
不透明塑料小瓶中 （直径 4 cm,长 8 cm） ,使其无法在
里面自由活动。限制应激每周 2次 ,每次 1 h。②高台
应激[ 8 ]
:把实验小鼠放置在一个 10 cm × 10 cm,高1 . 6m
的平台上 ,平台放置在光线良好的房间的*。高台
应激每周 2次 ,每次 1 h。③旁观电击应激:旁观电击
应激参照邹涛等[ 9 ]
的方案进行 ,旁观电击每周 2次 ,每
次 1 h,电击每次持续 5 s,频率为 1次 /min。
三、 工作记忆评定
根据文献自制的 T型迷宫[ 10 ]
由两条等长通道
（75 cm × 12 cm × 20 cm）组成 ,其中竖直部分的末端用
不透明活动门隔出 24cm的通道作为实验动物的起始
位置。而两臂的两端分别作为两个目标位置 ,在两臂
的入口分别有两扇不透明活动门 ,可以对活动门进行开关操作。在迷宫周围有明显的视觉参考物。实验开
始时将实验小鼠放置在起始位置处 ,打开起始位置的
活动门 ,关上其中一臂入口处的活动门。由于小鼠的
探索天性 ,小鼠会进入迷宫另一臂 ,实验小鼠探索完回
到起始位置后 ,关上起始位置的活动门 ,让实验小鼠在
起始位置内待 5 s,而后把三扇活动门全部打开 ,这时
实验小鼠能选择两臂中的任意一段进行探索 ,当实验
小鼠进入其中一臂后 ,关上另一臂的活动门。当实验动物从目标区域回到起始区域后 ,关上起始区域的活
动门 ,让动物在起始区域中待 5 s。以后重复第二个步
骤 14次。记录动物每次探索和前一次不同臂的比例 ,
即为 T迷宫正确转换数。
四、 组织收集
各组动物经在 2个月相应处理 ,行为观察 12 h后
断头处死 ,迅速于冰上剥出海马 ,液氮中冻存备用。
五、 提取蛋白和 western2 bl ots
取出冻存海马 ,液氮中研磨成粉,裂解液裂解提取
海马总蛋白 ,紫外分光光度法定量 ,上样 ,经 10% SDS 2
聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质 ,转膜 ,封闭 ,一抗
（ anti2 HSP72, anti2 HSP25, stressgen ） 4℃静置孵育过
夜 ,二抗室温摇床摇 1 h, DAB显色 ,全自动图像分析
系统进行光密度指数分析 , HSP含量以同一张膜上的
HSP含量与 GAPDH含量的比值来表示。
六、 数据分析
数据采用 SPSS12 . 0统计软件 ,数据采用均数 ±
标误表示 ,多组比较采用单因素方差分析和多因素析
因设计方差分析 ,两两比较采用 t检验。结 果
一、 工作记忆功能评定
HSF1基因、 热休克预处理、 心理应激对小鼠在 T
迷宫转换正确数的影响见表 1。单因素方差分析结果
显示:不同基因型、 不同处理组之间 T迷宫转换正确
数之间有显著性差异 （ F = 17 . 429, P = 0 . 000）。进一
步做三因素 （HSF1基因、 热休克预处理、 心理应激 ）析
因设计的方差分析 ,结果显示:对 T迷宫转换正确数
的影响 , HSF1基因具有主效应 （ F 1, 65 = 64 . 47, P =
0 . 00） ,心理应激具有主效应 （ F 1, 65 = 17 . 61, P =0 . 00） ,而热应激没有主效应 （ F 1, 65 = 0 . 32, P =
0 . 57） , HSF1基因与心理应激具有一阶交互作用
（ F 1, 65 = 14 . 62, P = 0 . 00）。对 HSF1基因与心理应
激的一阶交互作用做简单效应分析 ,发现在 HSF1 - /
-小鼠中 ,心理应激可以引起 T迷宫转换正确数明显
减少 （ F 1, 65 = 32 . 39, P = 0 . 00） ,而在 HSF1 + / +小
鼠中心理应激没有引起 T迷宫转换正确数明显减少
（ F 1, 65 = 0 . 23, P = 0 . 64）。见表 1。
表 1 T迷宫转换正确数 （次 , x ±s ）
组别 NS PS HS HS + PS
HSF1 + / + 9 . 58 ± 0 . 48
（ n = 12）
8 . 90 ± 0 . 46
（ n = 10）
9 . 17 ± 0 . 79
（ n = 6）
9 . 56 ± 0 . 63
（ n = 9）
HSF12/2 7 . 33 ± 0 . 43
（ n = 12）
4 . 00 ± 0 . 263
（ n = 6）
6 . 60 ± 0 . 40
（ n = 5）
3 . 60 ± 0 . 243
（ n = 5）
注:与 NS组, HS组比较,
3
P < 0. 05二、 热休克蛋白表达
1 . HSP72表达:Western印迹分析法检测海马内
HSP72的表达 （见图 1） 。结果显示 , HSF12/2 各组小
鼠 HSP72表达显著低于 HSF1 + / +各组小鼠。心理应激引起 HSP72表达在 HSF1 + / +小鼠 （ 1 . 35 ±
0 . 11）中显著高于 HSF12/2 小鼠 （ 0 . 23 ±0 . 03, P =
0 . 00）。同时 ,热应激预处理也诱导 HSP72表达在
HSF1 + / +小鼠中 （ 1 . 71 ±0 . 05 ）高于 HSF12/2 小鼠
（0 . 26 ± 0 . 03, P = 0 . 01）。
图 1 HSF1 + / +和 HSF12/2 小鼠各组 HSP72表达
2 . HSP25表达:Western印迹分析法检测海马内
HSP25的表达 （见图 2） ,结果显示 , HSF12/2 各组小鼠
HSP25表达显著低于 HSF1 + / +小鼠。心理应激引起
HSP25表达表达在 HSF1 + / +小鼠中 （ 1 . 05 ±0 . 03）
显著高于 HSF12/2 小鼠 （ 0 . 26 ±0 . 02, P = 0 . 00）。同
时 ,热应激预处理也诱导 HSP25表达在 HSF1 + / +小
鼠中 （1 . 33 ± 0 . 05）高于 HSF12/2 小鼠 （0 . 23 ± 0 . 08, P
= 0 . 01）。
图 2 HSF1 + / +和 HSF12/2 小鼠各组 HSP25表达
讨 论
本研究结果显示:慢性社会心理应激不引起 HSF1
+ / +小鼠 T迷宫转换正确数明显减少 ,提示慢性社
会心理应激不损害 HSF1 + / +小鼠工作记忆 ,这与既
往的研究结果相符合[ 2 ]
。采用 HSF12/2 小鼠进一步探
讨其机制发现 ,慢性社会心理应激引起 HSF12/2 小鼠 T
迷宫转换正确数明显减少 ,说明在没有了 HSF1基因
后 ,慢性社会心理应激损害了 HSF12/2 小鼠的工作记
忆能力。因此提示慢性社会心理应激不引起工作记忆
能力损害 , HSF1基因及其所调控表达的蛋白质的内源
性表达在其中起着重要的作用 ,而这种保护作用是由
心理应激本身来激活的。
为探讨 HSF1基因如何在心理应激中发挥保护作
用 ,本研究进一步比较 HSF1 + / +小鼠和 HSF12/2 小
鼠 HSP72、 HSP25表达的差异。结果发现:在 HSF1 + /
+小鼠 ,心理应激可诱导 HSP72、 HSP25在 HSF1 + /
+小鼠 PS组显著增加;而 HSF12/2 小鼠由于剔除了
HSF1基因 ,其海马内 HSP72、 HSP25表达被大大削弱。
这与心理应激不影响 HSF1 + / +小鼠工作记忆能力 ,
但损害 HSF12/2 小鼠工作记忆相符合。上述结果提示
慢慢性心理应激不影响工作记忆能力 ,这一保护作用是
通过心理应激激活 HSF1而实现的 , HSP72、 HSP25大
量诱导表达在其中起着重要的作用。同时本研究发现
热休克预处理也诱导 HSP72、 HSP25大量表达 ,但是并
没有发现热休克预处理诱导的 HSP72、 HSP25表达对
工作记忆具有保护性作用或损害作用 ,这与 McMorris
等人在青年志愿者中的研究结果是一致的。
本研究采用 HSF1基因敲除小鼠模型 ,证实
了慢性社会心理应激激活 HSF1基因 ,诱导热休克蛋
白表达 ,在慢性社会心理应激中对工作记忆发挥了自
我保护的作用 ,揭示了慢性社会心理应激过程中机体
的自我保护机制 ,具有重要的理论和现实意义。